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产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究

段妍  
【摘要】:壳聚糖酶是一种降解壳聚糖的专一性水解酶,可用于制备功能性的壳寡糖。本研究立足于从微生物中寻找高活性壳聚糖酶的新来源,以期对酶法制备壳寡糖的规模化生产及应用开发研究提供实验依据和基础。 本研究是对本实验室保种的一株产壳聚糖酶的微生物菌株P003进行了发酵条件优化,结果表明其最适培养条件为(%,w/v):(NH_4)_2SO_4 2.0%,粉末壳聚糖1.0%,葡萄糖0.1%,K_2HPO_4 0.07%,KH_2PO_4 0.03%,NaCl 0.5%,MgSO_4·7H_2O 0.05%,酵母提取物0.3%,调pH至5.0;接种量2.0%(v/v),以500mL三角瓶装量为150mL,32℃下150rpm摇床培养96h。该条件下发酵液的壳聚糖酶活力达108umol/mL.min,是迄今所见报道中发酵液壳聚糖酶活力最高的微生物菌株。 菌株P003发酵液中的壳聚糖酶经70%(NH_4)_2SO_4分级盐析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤后,获得了电泳纯的壳聚糖酶,分子量为30.5kD。对其进行酶学性质的研究表明该壳聚糖酶的最适作用温度为45℃,最适反应pH值为5.8,酶活力在pH5.0-11.0范围内和45℃以下时相对稳定;金属离子Mn~(2+)对酶活力有明显的促进作用,Hg~(2+)、Cd~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)和Ag~+则对酶活力具有明显的抑制作用;EDTA、氨基葡萄糖盐酸盐和SDS对酶活力亦具有不同程度的抑制作用,而蛋白抑制剂β-巯基乙醇对酶活力没有影响;该壳聚糖酶最适作用底物为胶体壳聚糖,其次为壳聚糖醋酸溶液,对胶体几丁质也表现一定的水解活性,但不能降解羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素。 采用该壳聚糖酶对壳聚糖进行酶解试验,发现约10.5U的该壳聚糖酶液至少可水解1g壳聚糖;酶解最适温度为45℃,最适pH值为5.8,壳聚糖底物脱乙酰度高于85%有利于酶解反应的进行。在最适酶解条件下酶解一定量壳聚糖,经乙醇沉淀获得了水溶性良好的壳寡糖,薄层层析显示该壳寡糖成分比较单一,乙酰丙酮法测得降解产物的数均分子量约为1220Da。


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