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新型β-琼胶酶工程菌株的构建、重组表达及体外复性的研究

张立  
【摘要】: 琼胶酶(Agarase)是能够降解琼胶的水解酶,根据其作用方式不同,可以把琼胶酶分为两类:α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1,3糖苷键,生成以3,6-内醚-α-L半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列;β-琼胶酶裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键,生成以β-D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。目前所发现的琼胶酶中,大多数都是β-琼胶酶,只有三种是α-琼胶酶。现今琼胶酶已广泛应用于食品、化妆品、医药行业以及基础研究领域,其生理功能越来越引起人们的关注。本实验室已从一株假别单胞菌CY24(Pseudoalteromonas sp. CY24)中克隆了一个新型β-琼胶酶AgaB,并且在E.coli中已重组表达了agaB基因。研究表明AgaB是一个结构和功能全新的β-琼胶酶,它属于一个新的糖苷水解酶家族。AgaB不同于已报道的琼胶酶(降解琼脂糖的主要终产物是新琼二糖、四糖或六糖),它降解琼脂糖的主要终产物是新琼八糖和十糖,因此琼胶酶AgaB将会在食品、化妆品、医药等行业以及生物技术研究领域发挥更大的应用潜力。 重组AgaB在pET24/BL21 (DE3)的表达系统中大部分为不可溶的包涵体形式,只有少量可以分泌到发酵上清液,分泌到上清液中的目的蛋白需经过硫酸铵沉淀、脱盐、离子交换、疏水层析、分子筛等系列纯化步骤,最终可以从1L发酵上清中分离得到2-3 mg纯蛋白,鉴于AgaB在该表达系统中纯化步骤多,诱导剂价格昂贵,耗时长(16小时)不利于大规模生产等特点,本文采用了温度控制型载体pBV220作为表达载体,为了方便纯化,分别在AgaB的N端和C端添加了六个组氨酸作为亲和层析纯化标签构建了两种重组子,经过比较其在不同宿主中的表达量,选定BL21(DE3)为其宿主菌。重组AgaB在42℃诱导4小时即可达到最高表达量,主要以包涵体的形式存在。菌体经过超声破碎、Triton X-100、DOC洗涤后得到高纯度的包涵体,包涵体用8molL-1的尿素溶解,经过镍离子亲合柱一步纯化得到大于95%纯度的目的蛋白,目的蛋白经脉冲稀释法进行复性,最终从1L发酵液中得到了40mg活性


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