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海参胶原蛋白生化性质及胶原肽活性研究

崔凤霞  
【摘要】: 海参(sea cucumber, holothurians)归属无脊椎动物棘皮动物门,以其较高的营养价值和药学价值而被列为“八珍”之一。全世界约有900多种海参,我国约有140多种,其中可供食用者约有40多种。仿刺参(Stichopus japonicus)生长于我国北部沿海,是目前已知营养价值最高的一种可食海参。 海参的体壁是海参的主要食(药)用部位,其主要成分为胶原蛋白、酸性粘多糖和海参皂甙。在过去的30年中先后有中医提出以海参单用或组方治疗肿瘤和糖尿病等都取得了良好的效果。国内外也有关于海参抗肿瘤、抗凝血作用和抗菌活性等方面的报道。但是,目前国内外对海参的活性研究主要集中于粘多糖、海参素、脂质以及微量元素等,对海参胶原肽活性研究未见报道。 和脊椎动物相比,海参胶原蛋白具有显著的难溶性。本论文即以仿刺参为研究对象,采用生化分离技术提取纯化未变性胶原蛋白,研究其生化性质及分子结构性质。采用商业酶对胶原蛋白进行酶解制备活性多肽,研究其抗氧化活性及其对小鼠B16黑素瘤细胞株的酪氨酸酶活性及mRNA表达的调控,并以抗氧化体系确定活性多肽的构效关系。在此基础上进行动物实验,最终确定海参中活性成分的特性。本研究对于进一步丰富胶原蛋白的研究领域,开发海参新的食(药)用功效,推进海参产业的发展提供科学依据。 1.对仿刺参体壁的营养成分组成测定发现,仿刺参体壁所含氨基酸种类齐全,氨基酸总量、必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总量及药效氨基酸总量分别达体壁干重的69.9%、19.0%、35.2%和37.6%。鲜活仿刺参体壁水分达91.44%,干物质含量低于体壁的10%。粗蛋白、多糖、脂肪、皂甙及灰分含量分别为干基的70%、13%、1%、0.04%及4.2%。差示扫描量热仪(DSC)测定冻干仿刺参体壁蛋白热收缩温度(Ts)为67.58℃。Van Gieson染色法观察体壁组织结构,发现胶原纤维和肌原纤维分布在仿刺参体壁的不同位置,其中大部分为胶原纤维,仅含少量肌原纤维。 2.对仿刺参胶原蛋白的提取及生化性质进行了研究。结果表明,低温提取可得到胃蛋白酶促溶且去除端肽的酸溶性胶原蛋白(PSC)。紫外-可见扫描测得PSC的最大吸收峰位于220 nm,具有较高的纯度;氨基酸分析发现,在1000个总氨基酸残基中,甘氨酸为329个,羟脯氨酸为66个,羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.69,酪氨酸、苯丙氨酸及组氨酸的含量较低,可能不含胱氨酸,这些特性均符合脊椎动物Ⅰ型胶原的特征。SDS-PAGE电泳图谱分析及Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析分离胶原α链,实验结果均表明,PSC分子组成为(α1)3,且α链类似于脊椎动物Ⅰ型胶原α1链,分子量约为135 kDa。苯酚-硫酸及次甲基蓝法测得PSC的总糖及粘多糖含量分别为0.61%及0.48%;经DEAE-52纯化后,可得到除去粘多糖的蛋白纯品;差示量热扫描法(DSC)测定PSC的热稳定性温度(Ts)为57℃,低于牛皮Ⅰ型胶原5℃。 3.对仿刺参胶原蛋白的分子结构进行了研究。胶原蛋白的V8蛋白酶切肽图分析表明,仿刺参PSC对V8蛋白酶的敏感性高于牛皮Ⅰ型胶原,和其氨基酸组成存在较多的Glu和Asp有关。PSC的双向电泳图谱表明,仿刺参PSC的等电点约为4.5~6.0,主要成分为α1链,MALDI-TOF-TOF质谱仪测定结果发现,α1链可能存在的肽段为AQVAANTK, YPGCSGSR, IIIDDIR, ELTDVINK, GHVVSQHR, YTGGNGVVR, GSGWNGSDAVHTNMTNTR及GTGGNSGNK。 4.采用风味蛋白酶从仿刺参(S. japonicus)、墨西哥参(Holothuria mexicana)及菲律宾刺参(Pearsonothria graeffei)体壁中提取胶原肽,并对其性质进行了表征。采用乙醇浸泡法除皂苷,300%乙醇沉淀水解液中多糖,从而可批量纯化制备海参胶原肽。采用高效液相色谱对其肽段分子量分布进行测定,结果表明三种胶原肽的主要平均分子量分布为1700 D,750 D及75 D。进行氨基酸组成测定发现,三种海参胶原肽所含氨基酸种类齐全,仿刺参、墨西哥参及菲律宾刺参氨基酸总量分别为胶原肽干重的99.21%、98.72%及50.27%;必需氨基酸总量分别占胶原肽干重的25.01%、15.41%及12.57%;鲜味氨基酸总量分别占胶原肽干重的53.82%、56.1%及26.32%;药效氨基酸总量分别占胶原肽干重的54.35%、51.65%及26.12%,表明海参胶原肽具有极高的营养及医学价值。 5.三种海参胶原肽对超氧阴离子(O2˙-)和羟基自由基(·OH)的清除作用表明,三种胶原肽均可有效去除超氧阴离子自由基及羟基自由基,清除作用随浓度的增大而增强。仿刺参对超氧阴离子的清除效果最好,IC50为2.18 mg/mL;墨西哥参H. mexicana对羟基自由基的清除效果最好,IC50为0.20 mg/mL。 6.采用ox-LDL建立血管内皮细胞氧化损伤模型,观察和比较了三种海参胶原肽对血管内皮细胞的保护作用。结果表明,三种海参胶原肽在48 h内均能显著促进ox-LDL诱导损伤的血管内皮细胞的增殖(P0.01),降低细胞内MDA水平(P0.01),显著提高细胞内NOS活性和NO释放量(P0.01),且其作用效果随浓度的增大而增强,其中仿刺参胶原肽的促进效果最好,菲律宾刺参的效果最差。 7.通过紫外线模拟日光诱发小鼠皮肤光老化模型,研究海参胶原肽对皮肤光老化小鼠的抗氧化和免疫功能的调节作用。结果表明,仿刺参胶原肽可显著降低紫外线光老化模型小鼠血清及皮肤中MDA含量,增加羟脯氨酸含量(皮肤),提高SOD及GSH-px的活性;显著增强紫外线光老化模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,提高小鼠脾指数和胸腺指数、脾B淋巴细胞及脾T淋巴细胞转化数(P0.05,P0.01)。 8.通过体外培养小鼠B16黑素瘤细胞株,研究了仿刺参胶原肽对B16细胞的酪氨酸酶活性及mRNA表达的调控。结果表明,仿刺参胶原肽能显著促进B16细胞生长(P0.05,P0.01),且剂量效应关系明显;低浓度的胶原肽对酪氨酸酶活性抑制无显著效果,当胶原肽浓度为100μg/mL时,对酪氨酸酶活性抑制率高达21.17%(p0.01),呈浓度依赖性抑制;可抑制小鼠B16F10细胞酪氨酸酶mRNA表达,随着海参胶原肽浓度的增加,抑制率由25μg/mL时的36.79%增大至100μg/mL的69.69%,其作用途径与抑制酪氨酸酶的生成量和激活有关。


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