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中肋骨条藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究

何闪英  
【摘要】: 对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定,是估算浮游藻类生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础,但目前还缺乏一种准确估算单一种类浮游藻现场生长率的技术方法。近年来,国际上对细胞周期标志物的研究显示,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)可能在浮游藻生长率研究中有巨大的潜在应用价值,这为藻类生长率的估算提供了新的研究视角。 本研究以中国近海常见的赤潮藻——中肋骨条藻(Skeletonema costatum)为研究对象,建立了有效提取中肋骨条藻RNA的方法,进而通过反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了其PCNA基因的部分序列,首次克隆测序得到了714bp的中肋骨条藻细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)基因序列,并分别建立了PCNA系统关系树和Cyt系统关系树。进一步地,根据得到的PCNA与Cyt b基因序列,分别设计了符合实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测要求的引物和TaqMan探针,建立了检测中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线,其曲线方程分别为:对PCNA,y = -3.055x + 41.093(r=0.999,其中x为细胞数对数值,y为CT值,R为相关系数);对Cyt b,y = -4.0x + 44.96(r= 0.997)。以16种藻为参照藻,对所设计PCNA的RFQ-PCR引物的特异性进行了验证,并通过对已知浓度样品的检测证明了所建立标准曲线的准确性。 以上述建立的系列试验研究方法为基础,系统研究了中肋骨条藻生长率与增殖细胞核抗原基因表达量之间的关系。研究结果发现,平均单细胞中PCNA表达量在培养的不同阶段变化很大,且变化趋势与生长率表现出良好的一致性,说明PCNA表达量与细胞分裂密切相关,体现了其作为细胞增殖指标的潜能;而Cyt b基因表达稳定,表达量变化很小,说明Cyt b基因是一个潜在的良好的内参基因。基于此,本研究提出可以PCNA为目的基因、Cyt b为内参基因,将PCNA基因的相对表达量(REQ)作为中肋骨条藻生长率的一个指标,并进而建立了实验室条件下PCNA相对表达量与中肋骨条藻生长率之间的关系式,为运用分子生物学技术实现中肋骨条藻现场生长率的估算奠定了基础,为赤潮藻研究提供了有效的观测和研究手段。


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