深海微生物次级代谢产物的抗肿瘤活性成分研究

【摘要】： 深海微生物生存环境特殊,其次级代谢产物化学结构新颖、种类繁多,是新活性先导化合物的重要来源。为了寻找抗肿瘤活性先导化合物,本论文采用活性追踪的方法开展了7株深海菌株和1株浅海放线菌中抗肿瘤活性次级代谢产物研究工作。内容包括:深海微生物抗肿瘤活性筛选;活性菌株抗肿瘤活性成分的追踪分离;单体化合物的结构解析;单体化合物体外抗肿瘤活性的初步评价。 对采集自西太平洋、东太平洋及印度洋等深海海域的226株微生物菌株和采自厦门海域和渤海近海的34株微生物菌株,采用MTT或SRB法,以tsFT210和K562等细胞为模型进行体外抗肿瘤活性筛选,获得了34株深海微生物活性菌株和7株近海微生物活性菌株;经活性复筛并结合TLC及HPLC化学筛选,选取了其中7株深海微生物菌株(3株细菌,1株放线菌和3株真菌)和1株近海放线菌作为本论文的研究对象。采用微生物发酵方法分别8株目标活性菌进行了大量发酵,用乙酸乙酯对发酵液进行萃取,获得发酵提取物的活性粗浸膏。采用正相和反相硅胶柱色谱、制备薄层色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备反相高压液相色谱等分离方法,从真菌FL30r(Phialocephala sp.)中分离得到25个化合物(1-25),从萨氏曲霉YH11-2(Aspergillus Sydowi)中分离得到16个化合物(26-41),从近海放线菌11014 (Streptoverticillium luteoverticillatum)中分离鉴定了29个化合物(42-70),从细菌39(Bacillus sp.)中得到10个化合物(47-49、71-77),从细菌133 (Pseudomonas sp.)的代谢产物中得到8个化合物(46-48、78-82),从细菌168 (Pseudomonas sp.)中得到9个化合物(46-49、78、83-86),从一株未鉴定放线菌YuCH中得到4个化合物(39、87-89),从真菌F23-2(Penicillium sp.)中得到6个化合物(90-95)。共计107个化合物。 采用现代波谱技术(UV、IR、NMR、MS、CD),并结合其理化性质,阐明了95个化合物的化学结构(化合物结构参见Fig. 1);其中新化合物13个,包括4个首次发现结构新颖的Sorbicillin三聚体Trisorbicillinoids(1-4)(到目前为止没有该类三聚化合物的报道),利用NOESY谱确定其相对构型,并根据该类化合物的可能生合成途径,结合CD谱,推测了该类化合物的绝对构型;3个新颖的Sorbicillin二聚体Bisorbicillinoids类化合物(5-7),1个新的Sorbicillinoids类化合物(13),1个苯并γ丁内酯化合物(21),1个倍半萜类化合物(22),1个γ吡喃酮衍生物(26),1个色原酮衍生物(27)和1个新颖的具有[4, 2, 2]环状结构的吩嗪类衍生物(71)。此外还有2个化合物(72,78)为首次从天然来源中分离得到。 另外发现的其他已知化合物的结构类型还涉及聚酮类化合物[8-12(Bisorbicillinoids)、14-20(Sorbicillinoids)、28-31(Citrinin derivates)],甾类(23-25、32-36、89、93-94),萜类(37),酯类[42-45(γ丁内酯)、78(磷酸酯)、38(脑苷酯类)、39、76-77、80(邻苯二甲酸酯)、66],苯的简单衍生物(40、59-62、64、79、86、95),生物碱类(63、73-75、83-85、46-58、88、91-92、68-70、81-82、87、90),γ吡喃酮衍生物(67),大黄素类(41)等。利用MTT法、SRB法以及流式细胞术结合形态学检测的方法,对分离获得的单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价。结果表明:结构新颖的三聚Sorbicillin化合物1对HL60和P388表现出较强的细胞毒活性(IC50分别为3.14和9.10μM);化合物2、3、4对P388和K562都具有较弱的细胞毒活性。新化合物6、7、26的对HL60的IC50分别为8.9、10.5和8.5μM,新化合物13、21、22和27对P388具有强的坏死性细胞毒活性(IC50分别为0.1、0.2、0.16和8.9μM);13和22对K562也具有强的坏死性细胞毒活性(IC50分别为4.8和0.05μM)。化合物71在50μM浓度下对P388具有细胞毒活性,抑制率为78.3%。并且首次报道了已知化合物16、17、18、20、24、28、29、30、36、40、42-45、72、78、80、85的细胞毒活性。 本文经活性筛选获得34株深海微生物重要活性菌株;通过对8株活性菌株(其中深海7株、近海1株)中次级代谢产物的系统研究,共分离鉴定了95个化合物,其中新化合物13个。首次发现了4个结构新颖的Sorbicillin类三聚体抗肿瘤活性化合物,其它新化合物均有一定程度的体外抗肿瘤活性。获得具有细胞增殖抑制活性的化合物32个,其中具有强活性的新化合物4个,首次报道了18个已知化合物的体外抗肿瘤活性。上述研究为抗肿瘤新药提供了先导结构,并为深海药用资源的研究提供了重要的基础。