食品中生物胺及其产生菌株检测方法研究

【摘要】： 本文建立了一种改进的丹磺酰氯柱前衍生RP-HPLC测定食品中生物胺的方法。方法以1,7-二氨基庚烷为内标,丹磺酰氯为衍生剂,通过优化试验确定了样品前处理和衍生条件。本法采用CAPCELL PAK C18色谱柱,荧光检测器(λex/λem=350/520)与紫外检测器(254nm)串联检测。以线性、精密度、检出限和回收率等为指标对方法进行了验证,结果表明, 8种标准生物胺在检测范围内,呈良好的线性相关(荧光,r=0.9981-0.9997;紫外,r=0.9981-0.9998)。荧光/紫外分别测定生物胺含量的RSD10%。荧光检测器检出限:0.06-0.5mg/L,紫外检测器检出限:0.07-0.28mg/L。本方法测定葡萄酒中8种生物胺的平均回收率79.2-127.5%;啤酒中8种生物胺的平均回收率78.9-109.9%;酱油中8种生物胺的平均回收率75.2-107.5%;食醋中8种生物胺的平均回收率90.1-106.6%;水产品中8种生物胺的平均回收率除色胺(回收率57.7%,相对标准偏差19%)外为93.6-110.3%;乳制品中8种生物胺的平均回收率61.0-112.7%。加标回收的RSD10%。本方法适合于不同基质食品中色胺,β-苯乙胺,腐胺,尸胺,组胺,酪胺,亚精胺和精胺等8种生物胺的测定。 本文采用建立的HPLC方法全方位测定了几种常见食品中生物胺含量,初步掌握了我国常见食品中生物胺的含量状况。主要结果如下: 1、测定国产葡萄酒和啤酒中生物胺含量:酒类样品中色胺未检出。干红葡萄酒中其它生物胺均有不同程度检出,腐胺检出率100%,其次为β-苯乙胺。干白葡萄酒中生物胺主要为腐胺,部分检出微量β-苯乙胺,其它生物胺未检出。啤酒中常见生物胺是腐胺、酪胺、亚精胺和尸胺,组胺含量低于2 mg/L。 2、测定国产酱油和食醋中生物胺含量:酱油中除色胺检出率为72.5%,其它7种生物胺检出率100%,酪胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺和组胺是其主要生物胺成分,个别样品中生物胺总量较高。食醋中腐胺和尸胺检出率较高,β-苯乙胺、组胺和酪胺在食醋中普遍存在,组胺含量超过50 mg/L的样品达28.9%。本文还测定了部分其它中国传统调味品和发酵食品中生物胺含量。 3、测定国产酸奶和奶酪中生物胺含量:酸奶中8种生物胺均有不同程度检出,但含量低,酪胺、腐胺、β-苯乙胺是酸奶中主要生物胺;奶酪中色胺、精胺、亚精胺未检出,β-苯乙胺和酪胺是其主要生物胺,但含量较低。 4、水产品:鱼类和虾类样品中均有少量的精胺和亚精胺检出。新鲜鱼肉中生物胺种类少、含量低,但对于冷藏质量稍差的鱼肉,可检出生物胺种类和含量明显增加。新鲜对虾中除尸胺含量较高外,其余生物胺含量与新鲜鱼肉相似。虾酱中组胺、酪胺、腐胺和尸胺的含量普遍较高。鱼肉罐头样品中除色胺未检出外,其它生物胺均有少量检出,但罐头样品中生物胺总量较低。 本文建立了检测产生物胺革兰氏阳性菌的聚合酶链式反应(PCR)体系。通过优化实验,确定了PCR反应的最佳条件,建立了一套分别检测产生组胺、酪胺和腐胺产生菌的单重PCR方法和可以同时检测产生组胺与酪胺、同时检测组胺与腐胺、同时检测酪胺与腐胺的二重PCR方法,并首次报道了以这三对特异性引物组合建立的一套同时检测组胺、酪胺和腐胺产生菌的复合PCR方法。对方法的敏感性、特异性作了验证。本方法具有简便、快速、特异性好等优点,为检测产组胺、产酪胺获产腐胺的革兰氏阳性菌提供了一种新的分子生物学手段。 采用建立的PCR方法对23株酒类酒球菌和109株乳酸菌进行安全评价。结果:酒类酒球菌均为非组胺、酪胺和腐胺产生菌,无潜在的生物胺危害。乳酸菌均为非组胺和腐胺产生菌株,但有44株含有酪氨酸脱羧酶基因,为酪胺产生菌。这一结果与HPLC测定结果基本一致。 本文对31株产酪胺乳酸菌PCR产物进行了测序,并对结果进行了比对分析。结果表明:以TD2/TD5为引物的PCR产物氨基酸序列中,均有酪氨酸脱羧酶蛋白序列中特有的高度保守序列LHVDAAY和PLP结合位点,证明31株菌的PCR扩增产物确是酪氨酸脱羧酶基因片段。酪氨酸脱羧酶基因及氨基酸序列具有一定程度的多态性。聚类分析结果表明:产酪胺乳酸菌仅具有菌种或菌株特异性,无菌属特异性。因此,酪氨酸脱羧酶基因不适于产酪胺菌的进化发育分析。