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乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达

王培林  
【摘要】: 乙型肝炎(简称乙肝)是乙型肝炎病毒(HBV)感染所致,是一种难治性的严重危害人类健康的常见病与多发病,是与慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌发生关联的疾病。据统计,世界上约有3亿五千万人携带HBV,每年新增乙肝患者50万~100万,我国感染人数约占世界感染人数的50%。乙肝每年导致至少200万人死亡。然而,迄今乙肝尚无特异有效的临床治疗对策与措施,乙肝的发生率尚未显著降低。因此,HBV感染的传播方式受到研究者们的关注;乙肝经生殖细胞垂直传播的途径尚未得到证实,有关研究报道甚少。HBV是目前所知的最小的嗜肝病毒。HBV DNA长约3.2kb,构成HBV基因组,为部分双链环状病毒。HBV基因组共有4个开放阅读框架P、C、S和X区。 本文报道了HBV基因组在男、女乙肝患者睾丸组织、卵巢组织中的基因复制、基因表达和基因突变,HBV基因组在乙肝患者父子、母子间垂直传递,HBV基因组小鼠卵细胞载体的构建和精细胞载体的构建与转HBV基因组小鼠的垂直传递。本研究从分子遗传学、细胞生物学和组织学等方面为HBV基因组经精细胞和卵细胞垂直传递提供了实验证据;乙肝患者的研究和动物实验证明,受到HBV感染的乙肝患者的生殖细胞能够把HBV基因组传递给其发病后出生子女。本文为乙肝垂直传播的理论提供了证据,为HBV感染的干预(如乙肝疫苗的应用等)提供了理论基础和依据。乙型肝炎患者父亲发病后出生子女 本文首先研究分析了较大家系、样本的乙型肝炎患者父亲(HBF)、乙型肝炎患者父亲发病后出生子女(HBFa)和乙型肝炎患者父亲发病前出生子女(HBFb)各实验组血清游离型、外周血单核细胞(PBMC)整合型HBV基因组检测率和HBV感染率,发现HBF、HBFa组的3项指标显著高于HBFb组,HBF与HBFa组的3项指标呈一致性增高。说明HBFa组的HBV基因组有可能从HBF组获得。进一步分析了整合在HBF与HBFa基因组内的HBV基因组突变,发现HBF与HBFa父子之间具有完全一致的聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)单链泳动变位;所分析的的3个家系5个成员的HBF与HBFa的HBV基因组,有U5样序列区和非U5样序列区的3个位点的单核苷酸多态性(SNP)突变位点完全一致,HBF家系2301父子U5样序列区和非U5样序列区的10个位点的SNP突变位点完全一致。提示HBFa的所有HBV基因组的SNP都应是由整合有HBV基因组的HBF基因组通过精细胞传递所致。为了在产生精细胞的睾丸及附睾组织寻找到组织与细胞学证据,作者又研究了HBF的睾丸及附睾组织细胞内的HBV基因组,发现在HBF睾丸及附睾组织中存在大量的HBV基因组,主要分布在曲细精管的基底部。显然,为HBV基因组在父子之间的垂直传递提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组父子间垂直传递的研究为首次报道。 第二,首次大样本的研究了乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)均阳性乙肝患者母亲(HBM)孕妇的卵巢组织样本HBV基因组基因的表达,检测HBsAg在卵巢组织的分布与表达,发现HBsAg主要分布在卵巢组织的血管管壁及周围的间质细胞内,在卵巢皮质的卵泡细胞胞质中检测到HBsAg。说明在卵巢组织和卵泡细胞内存有HBV基因组,卵巢组织和卵泡细胞受到了HBV的感染。为母婴之间HBV基因组通过卵细胞的垂直传递提供了组织学与细胞学的证据。进一步分析了HBM卵巢组织与外周血、HBM新生儿脐带血存在的HBV基因组。发现在HBM卵泡组织中检测到HBV基因组,其检测率与HBM新生儿脐带血中HBV基因组的检测率呈一致性增高,显著高于对照组。说明HBM新生儿细胞内的HBV基因组可能是来自HBM,是通过卵细胞传递而来。因为HBM孕妇的卵巢组织样本HBV基因组的免疫组化研究结果已提供了组织学与细胞学的基础。同时,本文进一步研究了HBM卵巢石蜡组织切片组织细胞内的HBV基因组与分布,发现在HBM卵巢组织中检测到HBV基因组,分别分布在卵巢皮质的卵泡细胞,髓质的血管管壁以及血管周围间质细胞中。说明HBV感染了卵巢组织,在卵巢组织和卵泡细胞中存在HBV基因组。又进一步为母婴间通过卵细胞垂直传递HBV基因组提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组母子间垂直传递的研究为首次报道。 第三,应用人的生殖细胞进一步研究HBV基因组的垂直传递,涉及伦理学的问题,显然是不可能的。我们应用阳离子脂质体-质粒pBR322-HBV DNA共转染小鼠卵细胞,证明HBV基因组可以通过脂质体转染进入小鼠卵细胞,卵细胞可以作为HBV基因组的载体;为培育证明HBV基因组可以经卵细胞垂直传递子代的动物模型提供了前提条件。 第四,运用精子载体共培养和体内转染法共转染小鼠精细胞,发现小鼠精子有一定俘获外源HBV基因组的能力,并发现HBV基因组在小鼠精细胞的分布。作者应用精子载体法建立了HBV基因组经精细胞垂直传播的转HBV基因组小鼠模型。为HBV基因组经生殖细胞垂直传递提供了实验证据。为HBV感染的垂直传播提供了实验证据。 HBV基因组垂直传递的研究有助于探讨、阐明HBV感染传播的机制与途径。除在乙肝传播的理论上有所突破之外,还将为HBV感染的临床预防提供理论依据和基础;这在降低乙肝发生率、提高人口素质、优生优育等方面都有重要的临床意义。


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