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海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀因子的纯化及其基因的克隆

王祥红  
【摘要】: 通过人工感染实验确定了酵母菌WCY为梭子蟹的病原菌,感染实验的梭子蟹的症状同梭子蟹“乳化病”症状相同;通过形态、生理生化和分子生物学鉴定,鉴定病原酵母菌WCY为梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)。 从海洋中分离的327株酵母中筛选出13株对病原酵母WCY有抑制作用的嗜杀酵母,对其抑菌效果做了比较,其中菌株YF07b具有最佳的抑菌效果。通过生理生化和分子生物学方法对海洋嗜杀酵母进行鉴定,结果显示在海洋嗜杀酵母中,汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)最常见,其中异常毕赤酵母(Pichia anomala)的抑菌能力最强。 研究了菌株YF07b的嗜杀因子在不同NaCl浓度(0%,3%,6%,8%)、温度(15,20,25,30,35℃)、pH(4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0)值条件下的抑菌效果。嗜杀因子的最佳作用条件是NaCl浓度8%、pH为4.5,培养温度为15℃。 研究了菌株YF07b的发酵培养条件,结果表明当海洋嗜杀酵母YF07b在温度为20℃,培养基中NaCl浓度为2.0%,pH为4.5时产生嗜杀因子的能力最强。 分离筛选的海洋嗜杀酵母YF07b经常规生理生化反应和分子生物学鉴定,为异常毕赤酵母(Pichia anomala),根据陆地嗜杀酵母Pichia anomala strain K的嗜杀因子(β-1,3-葡聚糖酶)的基因及相关序列设计引物克隆菌株YF07b的嗜杀因子基因序列,克隆得到的基因序列为1589bp,GenBank登录号为EF029071。与其它相关蛋白序列对比分析,确定此嗜杀因子基因的编码区(ORF框)为209 bp到1492bp。克隆基因的推导蛋白为427个氨基酸,推导蛋白与其他酵母菌相关蛋白的氨基酸序列的系统发育分析比对,与异常毕赤酵母(Pichia anomala Strain K)的亲缘关系最近。信号肽分析结果表明,推导蛋白的前17个氨基酸为信号肽 嗜杀因子经Sephadex G75凝胶过滤和DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换得到纯化,经SDS-PAGE检测得到分子量为47kDa的单一条带。纯化后的嗜杀因子有β-1,3-葡聚糖酶活性,并且纯化后的嗜杀因子仍具有抑菌活性。 纯化的嗜杀因子的最适作用温度为40℃,温度在60℃以下能保持稳定;在pH4.5时嗜杀因子的酶活最高,并且嗜杀因子在pH为3.0到5.0时是稳定的;Ca2+, Co2+, K+和Mg2+对嗜杀因子的活性有激活作用,而Fe2+, Fe3+, Hg2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+和Ag+对其活性有抑制作用;蛋白抑制剂1,10-菲罗啉,EDTA,SDS,PMSF和碘乙酸对嗜杀因子的β-1,3-D-葡聚糖酶酶活有抑制作用。嗜杀因子的米氏常数Km为1.17 mg/ml,Vmax为72.5μmol/min.mg;嗜杀因子水解海带多糖的产物为小分子的糖(单糖和双糖)。


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