浮游生物传播对虾白斑综合症病毒（WSSV）的研究

【摘要】： 从上世纪六十年代以来,对虾养殖业在世界范围内得到了快速的发展,然而由于1993年对虾白斑综合症(WSS)的暴发,使该产业的发展严重受挫。该病1993年首次在日本囊对虾养殖场暴发,并立即引起了各界的密切关注,因为该病是严重危害所有对虾养殖品种的一种病毒性疾病,可以造成对虾极高的死亡率和重大经济损失。对虾白斑综合症病毒(WSSV)的宿主范围极其广泛,这也是该病毒得以在世界范围内迅速传播的原因之一。虽然浮游生物作为WSSV宿主进入研究人员的视野已经十年多了,但是直到如今仍然缺少浮游生物作为媒介在WSSV传播中的实验证据。因此,本论文的目的就是检验浮游生物是否可以成为WSSV的传播媒介并研究其传播机制。 以对虾养殖池塘中常见的湛江等鞭金藻Isochrysis zhanjiangensis、亚心形扁藻Platymonas subcordiformis、盐藻Dunaliella salina和中肋骨条藻Skeletonema costatum四种浮游微藻为实验对象,在与病毒粗提液混合后0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168h采样,每个实验三个重复,研究其对WSSV的携带和传播。研究结果表明,这四种微藻和WSSV病毒粗提液混合后,经PCR检测发现,在混合后96 h内微藻都可以携带WSSV,其中湛江等鞭金藻和亚心形扁藻在144 h内为WSSV阳性,盐藻在120 h内为阳性,然后在不同时间之后呈现WSSV阴性,这说明浮游微藻可以携带WSSV。 通过病毒-浮游微藻吸附法对对虾池塘中三种常见浮游动物――壶状臂尾轮虫Brachionus urceus、克氏纺锤水蚤Acartia clausi和黑褐新糠虾Neomysis awatschensis进行了WSSV的感染实验,实验分对照、浸泡法和病毒-浮游微藻吸附法攻毒组三个处理,每个处理三个重复。套式PCR检测结果表明,对照组和浸泡法攻毒组中的三种浮游动物均为病毒阴性,而病毒-浮游微藻吸附法则使WSSV成功感染这些浮游动物,攻毒组中三个重复的检测结果均为阳性,从而找到了一种新的浮游动物感染WSSV的方法;同时表明,微藻可以传播WSSV。 采用病毒-浮游微藻吸附法使WSSV感染壶状臂尾轮虫,然后刺激其产生休眠卵,每个处理三个重复,套式PCR检测结果表明,轮虫的休眠卵和由此孵化出的幼体也为WSSV阳性,这表明,轮虫可以通过水平和垂直两种途径感染上WSSV。用WSSV阳性的轮虫投喂中国明对虾Fenneropenaeus chinensis第III期蚤状幼体(Z III),每个处理十个重复。实验表明,虽然幼体没有出现严重死亡,对照组的死亡率(34.67±15.11%)和攻毒组(39.47±15.44%)差异性也不显著( P 0.05);但是幼体的生长和变态却受到很大的影响,变态率(19.26±5.4 %)与对照组(74.22±10.18%)相比差异显著( P 0.01)。经套式PCR检测表明,攻毒组中40%的对虾幼体为WSSV阳性,而对照组全为阴性。由此证明,轮虫可以成为WSSV传播中的媒介。 通过套式PCR检测发现,环胶州湾对虾养殖池塘底泥分离出的150份桡足类休眠卵中14.67%为WSSV阳性。由这些休眠卵孵化而来的幼体中6%为病毒阳性,但是,从WSSV阳性休眠卵孵化而来的幼体病毒阳性率却高达36.37%。运用病毒-浮游微藻吸附法对桡足类的哲水蚤类Acartia sp.进行WSSV攻毒实验,套式PCR检测结果发现,攻毒组三个重复中的哲水蚤均为WSSV阳性,其所产的休眠卵以及由此孵化而来的哲水蚤幼体也为病毒阳性,而对照组中的哲水蚤成体、休眠 卵和幼体均为阴性。这表明,桡足类也可以通过水平和垂直两种途径感染WSSV。通过病毒-浮游微藻吸附法使桡足类美丽猛水蚤Nitocra sp.感染上WSSV,然后用这些病毒阳性猛水蚤投喂日本囊对虾Marsupenaeus japonicus的仔虾,每个处理四个重复,经过15天的投喂,攻毒组(PCO)仔虾的感染率是100%,死亡率是52.50±5.00 %,投喂WSSV阴性猛水蚤对照组(NCO)的死亡率是20.00±0.00%,两组相比差异显著(P 0.05)。为了确认WSSV阳性猛水蚤体内病毒的感染性,本实验还用病毒阳性猛水蚤的组织粗提液注射日本囊对虾稚虾,每个处理四个重复,攻毒20天后,对虾的死亡率是72.50±9.57%;一步PCR检测攻毒组的稚虾全部为病毒阳性,而注射病毒阴性猛水蚤组织粗提液稚虾的死亡率是22.50±5.00%,显著低于攻毒组(P 0.05);并且套式PCR检测该组对虾为阴性。本研究结果证明,猛水蚤可以作为WSSV的宿主而保持病毒的感染力,并成为病毒的传播媒介。 利用病毒-浮游微藻吸附法使不同发育阶段的卤虫感染WSSV,运用RT-PCR方法,以WSSV囊膜蛋白VP28的特异引物检测WSSV阳性的不同发育阶段卤虫,发现WSSV没有在卤虫体内复制,由此推断,卤虫可能只是WSSV的物理携带者,不是生物携带者或宿主。用感染WSSV的卤虫投喂实验动物,以检验卤虫传播WSSV的能力,同时尝试了寻找新的实验动物来代替对虾仔虾用于WSSV相关的实验。黑褐新糠虾Neomysis awatschensis和凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei仔虾摄食WSSV阳性的卤虫15天后,经套式PCR可以检测出均呈现WSSV阳性;而摄食WSSV阴性卤虫的实验动物呈现WSSV阴性。但是,摄食卤虫的实验动物死亡率没有显著性差异(P0.05)。这些结果说明,卤虫作为WSSV的物理携带者,可以通过食物途径传播病毒。另外,黑褐新糠虾和凡纳滨对虾仔虾摄食WSSV阳性中国明对虾肉糜后,全部死亡,套式PCR结果也为阳性。由此说明黑褐新糠虾是WSSV的一种易感动物,可以作为对虾仔虾的替代而用于WSSV的实验,充当实验动物。