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皱纹盘鲍表达序列标签及免疫相关基因的克隆与表达研究

郑明刚  
【摘要】: 本论文以皱纹盘鲍为研究对象,构建了其肝、肾组织的cDNA文库,并对文库进行了一定规模的测序。利用EST提示的信息成功克隆了与免疫相关的三个基因,神经肽Y受体、半乳糖凝集素和同种异体移植炎症因子-1。此外,还从EST序列中开发了15个微卫星标记,并利用这些标记对皱纹盘鲍两个养殖群体的多样性进行了分析。现将结果摘要如下: (1)以皱纹盘鲍的肝、肾组织为材料,构建了cDNA文库。经测定,库容为5.24×10~5 cfu/mL、插入片段大小为0.8~2.5 Kb。挑取文库中1445个重组克隆进行序列测定,得到了1282条高质量的EST。聚类分析得到了876个基因聚类,同源性对比发现有393个获得了功能提示,占总数的45%,其中与免疫相关的基因聚类有63个。 (2)根据EST提供的信息,采用RACE技术成功克隆了神经肽Y受体基因的全长cDNA序列。该序列全长1534 bp,包含一个59 bp的5′-UTR和396 bp的3′-UTR,开放阅读框长1053 bp,编码350个氨基酸。生物信息学分析发现,此NPY受体具有7个α跨膜螺旋,N端在胞外,被糖基化,C端在胞内,被磷酸化,在ILG-NI处有典型的信号肽裂解位点,裂解后释放了一个具有309个氨基酸的成熟多肽。RT-PCR研究显示该NPY受体在不同组织中的表达有明显的差异,用鳗弧菌进行刺激,发现NPY受体在鳃和肝脏中的表达量有明显的上升。 (3)成功克隆了半乳糖凝集素(Galectin)的全长cDNA序列。该序列全长2889bp,包含一个84 bp的5′-UTR和1868bp的3′-UTR,开放阅读框长921bp,编码307个氨基酸。生物信息学分析发现Galectin具有两个功能域,与哺乳动物具有很高的同源性。鳗弧菌刺激后,Galectin在肝脏中的增加量最大。不同时间的刺激结果显示,肝脏在12 h表达量达最高,24 h恢复至正常水平。 (4)成功克隆了同种异体移植炎症因子-1(AIF-1)的全长序列。该序列全长1302bp,包含一个42 bp的5’-UTR和804 bp的3’-UTR,开放阅读框长456bp,编码151个氨基酸。分析发现该基因具有一个EF-手形功能域,该功能域可以和Ca2+结合而被活化。差异表达显示,皱纹盘鲍AIF-1在鳃和肝脏中都有很高的表达量。不同时间的刺激结果显示,肝脏在8 h后表达量达最高值,24 h恢复至正常水平。 (5)通过Tandem repeats finder软件在获得的EST中查找微卫星位点,使用Primer Premier 5.0软件设计了41对引物。试验证明,41对引物中的15对引物可以得到扩增产物且具有多态性。利用这些标记对两个皱纹盘鲍养殖群体的多样性进行了分析,结果显示两群体平均等位基因数为2.0-13.5,平均观测杂和度为0.1635-0.9845,平均期望杂和度为0.317-0.8975。除位点Co119和Ca481外,其余位点都表现出了较高的杂和度和多态性,表明这些位点具有较高的多态信息含量,可以在皱纹盘鲍的群体遗传研究上进行应用。


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