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茶多糖的定量、定性及生物活性研究

周小玲  
【摘要】: 茶多糖(TPS)是从茶叶中提取的活性多糖的总称,其中既包括中性多糖和酸性多糖,但多为杂聚糖,分子量从4×104~10×104不等,具有降血糖、降血脂、抗氧化、增强免疫力等活性。多糖类初级产品中往往含有色素、多酚和一些小分子物质(单糖、寡糖)为TPS的分离纯化和生物活性的研究增加了较大的困难。本文对TPS的提取工艺、定量方法、指纹图谱以及不同纯度的TPS的降血糖、降血脂、抗癌等生物活性进行了相关研究。 采用二次响应面方法(response surface analysis,RSA)对水法提取TPS的提取工艺进行了优化。在浸提时间、浸提温度、料水比3个因素中,浸提温度对TPS的提取率的影响程度达到高度显著水平。TPS提取率与浸提温度、料水比、浸提时间的二次回归曲面为鞍面,需要通过岭嵴分析找出最佳提取工艺条件。岭嵴分析的结果结合实际操作的便利,将水浸提TPS最佳条件修正为提取温度80℃、浸提时间1.5 h、料水比1:20时,实际测得的提取率为1.22 %,与理论预测值相比相对误差在2 %左右。因此,采用RSA法优化得到的浸提条件参数准确可靠,具有实用价值。 采用果胶酶、胰蛋白酶以及复合酶等3种提取法和不加酶水浸提法为对照,提取崂山粗老绿茶中的TPS。结果表明,复合酶提取法的提取率最高,达到5.17±0.17%。对4种工艺获得的TPS,分别测定其多糖含量、单糖组成、氨基酸组成。结果表明4种工艺对提取的TPS的单糖组成种类影响不大。4种工艺获得的TPS的总糖含量由高到低依次为果胶酶法、复合酶法、胰蛋白酶法以及不加酶水浸提法,其中果胶酶法获得的TPS总糖含量高达95.26±4.09%,但其糖醛酸含量比其他3种工艺显著降低。4种工艺对提取的TPS的氨基酸组成种类影响亦不大,但对各氨基酸的含量有较大的影响。果胶酶法、胰蛋白酶法提取的TPS的各氨基酸含量与不加酶水浸提法的相比有较大的减少。 按统一的TPS提取工艺对不同等级的绿茶(龙井特级、龙井1~4级)及不同茶类(绿茶、乌龙茶、黑茶和红茶)样品中的TPS进行分离纯化,并对分离纯化后的各TPS样品进行了组成分析。发现从不同的茶叶中分离纯化得到的TPS含有相同的单糖组成和氨基酸组成。TPS的多糖部分主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖以摩尔比1:1:0.5组成,TPS中的糖醛酸含量在17~23%之间;蛋白质部分由16种常见氨基酸组成,其中Val, Ala, Gly, Glu为主要部分。在该结果的基础上,以纯化后的TPS纯品作为标准与苯酚-硫酸反应,以吸光值和TPS质量作图获得相关系数为0.9961的标准曲线。该方法的TPS回收率为84.88 to 95.7%标准偏差为5.53%。从而建立了够快速和可靠的定量分析绿茶和乌龙茶中TPS的方法。 高效凝胶渗透色谱和成分分析揭示了绿茶中3种不同纯度的TPS产品:TPS I、TPS II和TPS III的分子量分布和组成,表明100 ~ 120 KDa的组分(主要由阿拉伯半乳聚糖蛋白组成)在TPS I、TPS II and TPS III中所占比重逐渐增加,分别约为30%、60%和90%。 建立了绿茶TPS的红外二阶导数指纹图谱。TPS I、TPS II和TPS III的红外二阶导数图谱中在1075、1045 cm?1均有吸收峰,它们分别是阿拉伯半乳聚糖蛋白主链半乳糖吡喃环和侧链阿拉伯呋喃环的特征吸收峰,并且吸收峰的峰强随绿茶TPS的纯度的提高而加强。 向量夹角余弦法被用于评估两光谱指纹图谱的相似度。每一光谱被认为是向量空间的一向量,它们的相似度用向量夹角公式计算得出。两向量的cosθ值越接近1,它们的相似度就越大。本文采用红外二阶导数光谱1200–800 cm?1区域计算TPS光谱的相似度。TPS II和TPS III的cosθ值是0.82,TPS I和TPS III的cosθ值是0.26,TPS II和TPS I的cosθ值是0.52。其它绿茶TPS II与标准TPS III之间cosθ值在0.7~0.9之间。而其它样品与TPS III的cosθ值计算出来后能够通过该值简单快速的区分开。至此,向量夹角余弦法提供了一种有效的绿茶TPS的质量控制方法。 TPS I、TPS II和TPS III对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖效果。检测了它们对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖值、糖化血清蛋白和丙二醛水平的影响。结果表明,与对照组相比TPS I、TPS II和TPS III能够显著的降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖值、糖化血清蛋白水平。经过14天治疗,这3种纯度的TPS能显著的降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的口腹葡萄糖耐量。TPS II在800 mg/kg.d和TPS I在400 mg/kg.d时均能显著的预防四氧嘧啶诱导的高血糖。综合以上,结果表明绿茶TPS,一种水溶性的阿拉伯半乳聚糖蛋白,是茶叶中的主要降糖因子。 TPS I、TPS II和TPS III的体外抗氧化活性研究表明它们清除羟基自由基和超氧阴离子的能力随着TPS纯度的提高而降低。 研究了TPS I、TPS II和TPS III对大鼠高血脂症的预防和降低作用。考察了它们对血清总甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量。结果,绿茶TPS对高血脂症大鼠血清TG、HDL-C、LDL-C水平无显著影响。只有TPS III对高血脂症大鼠有显著的降低总胆固醇的作用。并且TPS III能显著的增强高血脂症的抗氧化能力。3种TPS产品对高血脂症大鼠的肝脏中的微量元素有影响,能显著增加它们的镁、铜、锌含量以及提高它们锌/铜比值。暗示绿茶TPS对高血脂症可能有调节作用。 研究了TPS I、TPS II和TPS III对正常肝细胞HL-7702和对肝癌细胞SMMC-7721的抗癌活性。发现TPS II能有效的抑制SMMC-7721的生长而且对正常肝细胞HL-7702生长没有影响。TPS I既能抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长也能抑制HL-7702的生长。TPS III对肝癌细胞的SMMC-7721的抑制率比较低。 本文表明绿茶中的TPS具有很大的潜力开发为一种降血糖、降胆固醇的功能食品成分,具有广阔的应用前景。


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