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中国对虾(Penaeus chinensis)孵化酶的分离纯化、性质及其鉴定研究

赵君  
【摘要】: 在早期胚胎发育过程中,许多种动物的胚胎周围都包被有一层保护性外膜,称之为卵壳。发育到特定阶段后,胚胎必须从这层膜的包围中解脱出来,才能进一步生长和发育,这种脱出称为孵化。孵化酶(HE)是由动物早期孵化胚胎中孵化腺细胞特异性分泌的、在孵化过程中起关键作用的一种蛋白酶,它是研究早期胚胎发育过程中特定阶段特定蛋白质的基因表达及其调控机制的一个理想分子模型,查清孵化酶的性质对于研究动物的孵化机制以及动物孵化率的控制技术具有重要的理论意义。目前,对动物孵化酶的研究主要集中在两栖类和鱼类动物中,对对虾孵化酶的研究极少。为了查清中国对虾孵化酶的性质,本文首次利用凝胶过滤和离子交换柱层析对中国对虾孵化酶进行了分离纯化,并以酪蛋白和孵化酶特异性底物卵膜对其生化性质和酶性质进行了研究,进而用免疫组化和电镜技术对孵化前后胚胎中的孵化酶和分泌细胞进行了初步鉴定。 本文利用67%硫酸铵沉淀、Sephacryl凝胶过滤柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析,经过卵膜降解活性鉴定,从中国对虾胚胎孵化液中成功纯化出了中国对虾孵化酶,所得纯化样品的得率为44.29%,纯化倍率为48.05,其在SDS-PAGE电泳中的分子量约为43 kD,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为6.0,其对酪蛋白降解活性的Km值为7.47 mg/ml。抑制剂对其酶活性的影响结果显示,该孵化酶的活性几乎可被SBTI、p-APMSF、Bestatin和NEM所完全抑制,被ovomucoid、TLCK、IAM、chymostatin和PMSF所强烈抑制,而对pepstatin A、TPCK、LBTI和leupeptin不敏感,表明该酶极可能是一种属于胰蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶。EDTA、DETC和几种金属离子对该酶活性的影响结果发现,该酶对EDTA、DETC、Zn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)和Cu~(2+)非常敏感,表明该孵化酶有可能是一种金属蛋白酶。金属离子的活性回复结果显示,为EDTA所抑制的孵化酶活性几乎可被10mmol/l Zn~(2+)完全回复,进一步证明中国对虾孵化酶很可能是一种Zn -金属蛋白酶。 为了验证从中国对虾胚胎孵化液中分离纯化孵化酶的实验方案以及所得酶为中国对虾孵化酶,本文利用免疫组化和电镜技术对中国对虾孵化酶在孵化期胚胎中的出现情况及分泌细胞的超微结构进行了研究。免疫组织化学染色结果显示,在中国对虾孵化期胚胎中,出现了大量的孵化酶;透射电镜研究结果显示,在中国对虾孵化期胚胎中,出现了含有大量酶原颗粒的孵化腺细胞;说明中国对虾胚胎在孵化期合成了大量的孵化酶,也证明本文利用中国对虾胚胎孵化液分离纯化孵化酶的实验方案是切实可行的。综合上述研究结果以及在中国对虾孵化酶分离纯化时使用了孵化酶的特异性底物——卵膜,从而证实本文从中国对虾胚胎孵化液中分离纯化出的酶为中国对虾孵化酶,该酶极可能是一种属于Zn -金属蛋白酶类型的胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶。中国对虾孵化酶性质的查明,为进一步研究中国对虾孵化机制及其孵化率提高技术奠定了理论基础。


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