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刺参(Stichopus japonicus)烂皮病病灶组织显微观察及病原的初步研究

马海燕  
【摘要】: 刺参(Stichopus japonicus)属于棘皮动物门海参纲(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirota)刺参科(Stichopodidae)仿刺参属(Apostichopus)。刺参为温带种,在我国的分布主要在辽宁,河北,山东和江苏等沿海省。刺参营养丰富,体壁含有丰富的胶原成分和蛋白聚糖,还含有大量的黏蛋白及多种氨基酸。刺参的酸性黏多糖(硫酸软骨素),具有抗衰老的作用,还具有较广的抗肿瘤、抗凝血以及增强机体免疫功能的作用。 我国从20世纪80年代开始进行刺参养殖,目前国内刺参养殖规模不断扩大。山东、辽宁两省是我国的刺参养殖的最主要的养殖区域,青岛、威海、蓬莱等沿海城市都有大规模的刺参养殖场。随着国内刺参养殖业的迅速发展,养殖面积的迅速扩张以及集约化养殖方式下的不规范操作,养殖过程中相继出现一系列病害问题,给刺参养殖业带来了巨大的损失。 “烂皮病”因其高传染性,死亡率高而成为刺参养殖病害研究的重点。该病发病特征:染病初期的海参一般先从口部出现感染,表现为围口膜松弛,触手对外界刺激反应迟钝,继而大部分海参会出现排脏现象。中期感染的刺参身体收缩,僵直,一般口腹部出现小面积溃疡,形成蓝白色小斑点,渐渐丧失摄食能力,感染末期刺参的病灶变大,溃疡处增多,表皮腐烂面积变大,最后导致刺参死亡,溶化成鼻涕状胶体。 本文通过显微观察技术(H.E.染色切片观察、电子投射电镜和扫描电镜)对青岛某养殖场患病刺参和健康刺参个体进行比较。并对患病个体病灶处的优势菌群进行分离、纯化和人工回接感染实验,依据柯赫氏法则确定病原菌。并通过革兰氏染色、细菌负染形态观察、抗生素敏感实验、生化指标测定以及16S rRNA基因进化分析对病原菌进行初步鉴定和研究。并研究了病灶处优势菌群16S rRNA基因的系统发生关系。 病灶处显微观察结果:患病个体表皮严重的破损,结缔组织胶原层结构不再紧实有序,变薄且成絮状,出现大量空洞。肌肉层肌腱依然可见纤维束状结构,肌肉纤维束排列紧密,但没有成规律的麦穗状排列。病灶处各组织未发现在健康个体中存在的一种泡状细泡。电子透射电镜观察结果显示患病个体结缔组织中的细胞分散,细胞间质稀疏,细胞间隙较大,胞质内结构单一。细胞核核膜结构丧失,染色质结构散乱;细胞膜结构不完整。电子扫描电镜显微观察结果显示病灶处存在大量球状细菌,多附着于骨片和胶原纤维之间。 病原研究结果:共有9株优势菌株从病灶处分离纯化。编号依次为:C6、TB、4、BP1~BP6。仅菌株C6可以重复自然状态的发病状态,投放初浓度为108 CFU/mL,致死率为59%以上,确定为养殖刺参烂皮病的病原,培养菌落颜色为玉米黄色,可反射蓝色金属光泽。菌株C6为革兰氏阴性长杆菌,可弯曲,两端不生鞭毛;大小约为2μm×0.3μm,对氯霉素、林可霉素等抗生素表现为敏感;测试的16项生化指标仅氧化酶、鸟氨酸脱羧酶结果为阳性。结合表型,生化指标结果和16S rRNA基因进化分析,初步推测菌株C6为Tenacibaculum属细菌。16S rRNA基因的系统发生关系显示病灶处其他优势菌群和CFB群以及γ-变形菌门的交替单胞菌纲和弧菌纲细菌同源性最高。


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