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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌鱼分子细胞遗传学分析

王旭波  
【摘要】: 本研究对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌鱼进行了分子细胞遗传学分析,主要包括:半滑舌鳎雌鱼基因组结构特征分析、fosmid文库克隆的染色体荧光原位杂交分析、半滑舌鳎W染色体的激光显微切割及扩增、W染色体文库的构建及分析、半滑舌鳎雌鱼特异片段的获得及分析等。同时,要实现半滑舌鳎的全雌育种,有两个技术问题需要解决:(1)、如何区分ZZ和ZW,即如何鉴别雌鱼和雄鱼,从而筛选出性逆转的伪雄鱼;(2)、如何区分ZW和WW,即如何筛选出超雌鱼。本研究建立了双引物PCR法并获得了雌鱼特异性FISH探针,分别解决了这两个难题。主要结果如下: 1、半滑舌鳎雌鱼基因组结构特征分析 本研究利用流式细胞术对半滑舌鳎、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、石鲽(Kareius bicoloratus)和圆斑星鲽(Verasper variegates)的基因组大小进行了测定并进行了比较,检测结果为:半滑舌鳎雄鱼基因组大小为586.80 Mb,雌鱼基因组大小为606.36 Mb。同时我们发现无法利用流式细胞仪通过检测红血细胞的DNA含量的方法来鉴别半滑舌鳎的雄鱼和雌鱼。 随机挑取1,152个半滑舌鳎雌鱼fosmid文库克隆进行双末端测序,获得2,247条序列。序列总长1,921,341 bp,大约占半滑舌鳎雌鱼基因组的3.17‰。对这些序列进行如下分析:首先利用Tandem Repeats Finder (TRF)软件进行串联重复序列的查找,结果共得到889条重复序列,其中微卫星序列303条,小卫星序列586条,分别占串联重复序列总数的34.09%和65.91%,没有找到卫星序列。从长度上看,所有串联重复序列总长105,307 bp,其中微卫星序列19,363 bp,小卫星序列85,944 bp,分别占串联重复序列总长的18.39%和81.61%,占测序总长的1.01%和4.47%。 其次,通过在线服务器RepeatMasker查找,共获得38条散布重复序列,总长4,983 bp,占测序总长的0.26%。查找到的散布重复序列共有4种类型:DNA转座子、LTR反转座子、LINE反转座子和SINE反转座子。与散布重复的其它类型相比,DNA转座子在数目和长度上均占有绝对优势。 2、半滑舌鳎雌鱼fosmid克隆的染色体定位分析 根据对fosmid克隆两端序列的分析及BLAST比对结果,我们选择了8个克隆进行FISH定位。其中5个克隆含有单拷贝基因,有4个克隆获得了稳定又清晰的单一信号,另外1个克隆的信号出现在了几乎所有的染色体上。余下的3个克隆均含有rRNA基因序列,我们尝试对它们进行染色体定位,结果有2个克隆在W染色体和3对常染色体上出现阳性信号,而另1个克隆只在1对常染色体上出现杂交信号。以上FISH杂交结果将有利于半滑舌鳎细胞遗传学研究,比如基因的染色体定位,性染色体的进化,染色体重排等工作的开展。 3、半滑舌鳎雌鱼W染色体的显微分离及W染色体文库的构建和分析 利用Leica LMD激光显微切割系统对半滑舌鳎W染色体的显微切割进行了探索,成功地将W染色体显微分离,进行了DOP-PCR扩增,并将PCR扩增产物定位在了W染色体和Z染色体上。同时利用W染色体的扩增产物构建了半滑舌鳎的W染色体文库,共获得了596个克隆。从中选取288个克隆测序,得到了259条序列。对这些序列进行了串联重复、散布重复及BLAST比对分析,结果发现共有52条串联重复序列,2条散布重复序列。其中串联重复序列中有12条微卫星序列,40条小卫星序列;而2条散布重复序列全部都是DNA转座子类型。值得一提的是,我们发现有9个克隆均含有一段几乎完全相同的近540 bp的序列,从而推断半滑舌鳎的性染色体可能含有大量的多拷贝重复序列。 4、半滑舌鳎性别相关片段的获得及分析 对W染色体文库克隆的序列进行引物设计,利用5条雌鱼和5条雄鱼的DNA为模板进行PCR筛选,共获得2对半滑舌鳎雌鱼的特异性引物,加上1对阳性对照引物,我们建立了双引物PCR法,该方法可以非常准确迅速地区分半滑舌鳎的雌鱼和雄鱼。同时利用这2对特异性引物对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库的超级池和二级池进行筛选,最终获得了2个雌鱼特有的fosmid克隆。通过FISH定位分析,这2个克隆均定位在了W染色体的中部且序列比对无相似性。利用这2个克隆制成的雌鱼特异性FISH探针进行荧光原位杂交,将有助于我们筛选出半滑舌鳎WW超雌鱼。该成果将有助于推动半滑舌鳎全雌育种的研究实施及推广进程,从而极大地提高半滑舌鳎的养殖效益。


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