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海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的生产、分离纯化、基因克隆及表达的研究

李晓宇  
【摘要】: 采用单因子试验和表面响应的方法相结合,对产植酸酶培养基组分及条件进行了优化,结果如下:燕麦1.0% (w/v),葡萄糖2.0% (w/v),硫酸铵2.3% (w/v)氯化钠2.0% (w/v),初始pH6.3,培养温度28 oC,培养72 h植酸酶的产量达到最高575.5 U/mL,这同软件预测的569.16 U/mL基本相一致。 K. ohmeri BG3胞外植酸酶酶通过分子筛SephadexTM G-75和阴离子交换层析柱DEAE Fast Flow分离纯化,纯化倍数和回收率分别为7.2和10.4%。纯化后植酸酶SDS- PAGE凝胶电泳显示分子量约为98.2 kDa。纯化酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65℃,该酶的温度稳定性较好,在pH3-9范围内稳定性也较好。Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Li~+、K~+、Na~+、Ba~(2+)和Co~(2+)在浓度5.0mM时对纯化植酸酶有激活作用;而Zn~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Hg~(2+)、Ag~+、和Cu~(2+)在浓度5.0 mM时,对纯化的植酸酶有抑止作用。纯化的植酸酶活性被Phenylgloxal hydrate强烈抑制,因此分离纯化的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶。纯化的植酸酶对底物植酸的动力学常数Km值和Vmax分别是1.45 mM和0.083 mM/min。 用简并引物法扩增了编码海洋酵母K. ohmeri BG3植酸酶的部分基因,片段长度为1023 bp,NCBI登录号为EU009483。用RACE的方法扩增出了海洋酵母K. ohmeri BG3植酸酶基因5'和3'两端的区域,推导出了该植酸酶基因ORF框,共为1389 bp(NCBI登录号:EU082006)。通过比对海洋酵母K. ohmeri BG3植酸酶的基因序列和cDNA序列,发现两者完全一致,说明该基因没有内含子。K. ohmeri BG3植酸酶基因中含有两个酸性磷酸酶所特有的保守区域RHG X RX P和HD区域,这也说明该植酸酶属于酸性磷酸酶家族的一员。根据基因推导出K. ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列,共462个氨基酸,分子量为51.9 kDa。有一段含有15个氨基酸的信号肽,有6个糖基化位点。分析了K. ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列与其他植酸酶氨基酸序列的同源性,发现其与C. albicans (XP_713452)和P. stipitis (XP_001385108)植酸酶亲缘关系最近,同源性分别为61%和58%。 利用pET表达系统成功实现了植酸酶基因PHY1在大肠杆菌中的表达,重组蛋白部分以活性蛋白形式存在,而大部分以包涵体形式存在。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为51 kDa。重组酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65oC,该酶的热稳定性较好,在pH 3-8范围内稳定性也较好。重组酶在较短时间内可以将植酸水解为不同大小的水解产物,但不能将植酸彻底水解为肌醇。


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