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普鲁兰短梗霉HN2-3脂肪酶的生产、分离纯化、基因克隆和表达的研究

柳志强  
【摘要】: 从盐场分离到一株高产脂肪酶的酵母菌HN_2-3,经酵母常规鉴定方法和分子生物学方法鉴定为普鲁兰短梗霉。该酵母生产脂肪酶最佳培养基组分为3.0% (w/v)橄榄油、0.4% (w/v)葡萄糖、0.6% (w/v)硫酸铵、0.1% (w/v) K_2HPO_4和0.05% (w/v) MgSO_4.7H_2O,最佳培养条件为初始pH 7.0、培养温度25 oC和转速170rpm。我们发现橄榄油的添加时间对于脂肪酶的生产具有很大的影响,在接种培养6 h后加入橄榄油,继续培养96 h,脂肪酶产量达到最大,酶活力达到8.0 U/ml。 普鲁兰短梗霉HN_2-3胞外脂肪酶通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析得到纯化,纯化倍数为3.4。SDS- PAGE显示该脂肪酶分子量约为63.5 kDa。纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8.5和35oC,该酶被Hg2+, Fe2+和Zn~(2+)强烈抑制。同时苯甲基磺酰氟可以强烈抑制该脂肪酶的活性,乙二胺四乙酸对该纯化酶的影响不大,碘乙酸可以微弱抑制该酶的活性。纯化的脂肪酶对于花生油具有较强的水解活性。 利用RACE的方法克隆了普鲁兰短梗霉HN_2-3胞外脂肪酶的基因。该基因含有一个1245bp的ORF框,同时发现从基因组克隆得到的脂肪酶基因序列中含有一个55bp的内含子。该基因编码一个414个氨基酸残基的蛋白质,在氨基端含有一个26个氨基酸残基的信号肽。推导氨基酸序列含有脂肪酶的保守序列 (G-X-S-X-G)和3个推测的N-糖基化位点。通过脂肪酶系统进化树分析,普鲁兰短梗霉HN_2-3脂肪酶与Aspergillus fumigatu(sXP_750543)和Neosartorya fischeri (XP_001257768)脂肪酶亲缘关系最近,同源性分别为50%和51%。 将脂肪酶基因克隆到pET-24a (+)表达载体上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析发现重组蛋白的分子量约为47kDa。测定了阳性克隆BL21(DE3)/pET-24a(+)LIP1细胞裂解液的脂肪酶活力,达到0.96 U/mg。重组脂肪酶最适作用pH和最适作用温度分别为8.0和35°C,重组脂肪酶依然对花生油具有较高的水解活性。


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