海洋金黄色隐球酵母菊粉酶发酵生产、酶的分离纯化以及基因克隆的研究

【摘要】： 菊粉是存在于菊芋,大丽花和菊苣根中的一种主要碳水化合物。菊粉酶能够水解菊粉,产物是果糖和低聚果糖。果糖拥有甜度高,热量低,不易造成龋齿,糖尿病患者也可使用的优点。而低聚果糖其生理功能更加广泛,有提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇,促进矿物质吸收等作用。因此菊粉酶应用前景广泛。 许多种酵母所产的酶诸如脂酶,蛋白酶,菊粉酶,植酸酶等已经工业化生产了。在这些酶类中,菊粉酶受到了广泛的重视。虽然有很多关于陆地酵母产菊粉酶的研究,但是目前并没有关于海洋酵母产菊粉酶的报道。 我们对从不同的海洋环境中分离到的500多株酵母进行了筛选,发现分离自中国南海海泥中的酵母G7a能够产生大量的菊粉酶。根据传统的鉴定方法及分子生物学鉴定,G7a最终被鉴定为Cryptococcus aureus(金黄色隐球酵母),这是关于海洋隐球酵母产菊粉酶的首次报道。G7a所产的菊粉酶在pH 5.0以及温度50oC时展现出良好的酶活性。最佳的产酶条件是:用人工配置的海水培养发酵,其中含菊粉4.0% (w/v), K_2HPO_4 0.3% (w/v),酵母提取物0.5% (w/v),KCl 0.5% (w/v), CaCl_2 0.12% (w/v), NaCl 4.0% (w/v)以及MgCl_2·6H_2O 0.6% (w/v)。在最佳条件下摇瓶发酵42小时后酶活力达到85.0U/mL。在酵母所产的菊粉酶中该酶活力已经达到了相当高的水平。用粗酶液水解菊粉,产物中含有大量的单糖及寡聚果糖。 为了开发菊粉酶的应用潜力,我们对菊粉酶进行了纯化,并对酶学性质进行了全面研究。本研究收集了海洋酵母G7a的发酵液,经过超滤,浓缩,分子筛以及离子交换柱等步骤进行纯化后发现其特异性酶活力增加了2.44倍。纯化后的菊粉酶经测定分子量是60.0 kDa。纯化后菊粉酶的最佳作用pH和温度分别是5.0和50°C。Ca~(2+), K~+, Na~+, Fe~(2+)和Zn~(2+)能够促进酶活的提高,然而Mg~(2+), Hg~(2+)和Ag~+对纯化后的菊粉酶有抑制作用。苯甲基磺酰氟(PMSF),碘乙酸(iodoacetic acid)与乙二氨四乙酸(EDTA)能够强烈的抑制酶活性。纯化后菊粉酶对底物菊粉的Km和Vmax分别是0.1114 mol/L与0.0085 mg/min。水解产物中存在的大量单糖表明纯化后的菊粉酶有很强的外切酶活性。 水解大量的菊粉需要高浓度的菊粉酶溶液。因此本研究以Plackett–Burman design为基础采用响应面(RSM)法对Cryptcoccus aureus G7a固体发酵(SSF)产菊粉酶的产酶条件进行了优化。采用五因素五水平的设计方案,在最佳条件下:即湿度61.5%,接种量2.75%,底物配比(麸皮:稻壳)0.42,温度29 oC,pH 5.50发酵,根据统计学预测的每克底物干重里的菊粉酶酶活力最大可达436.2U,发酵120小时后,实验过程中实际测得的酶活力是每克底物干重420.9U,这比以往报道的酵母所产菊粉酶的酶活力都要高。 利用SMARTTM RACE cDNA amplification kit试剂盒,通过反转录合成Cryptococcus aureus G7a的cDNA链,我们得到了该胞外菊粉酶的基因。该基因含有一个编码菊粉酶的1557bp的开放阅读框,没有内含子存在。该基因编码518个氨基酸其中包括一个推测得到的含有21个氨基酸残基的信号肽。由菊粉酶基因推测出的蛋白序列含有六个可能的N-糖基化位点,该菊粉酶与Cryptococcus neoformans和Aspergillus fumigatus的β果糖苷酶的相似性分别达到了71%与58%。 另外,海洋酵母G7a不仅能产生大量的菊粉酶,同时它还是一个优良的单细胞蛋白源,因此对该酶的研究具有重要的工业应用价值。