皱纹盘鲍和栉孔扇贝抗菌肽的研究

【摘要】： 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国黄渤海区的重要自然资源,也是我国北方的重要养殖品种。九十年代中期以来,病害频繁发生,造成的经济损失达百亿元,直接威胁到现有产业的生存。为了促进我国贝类养殖业的复兴和健康发展,实现我国蓝色农业的可持续化,海水养殖动物的免疫抗病机制成为最突出和亟待解决的问题。 抗菌肽(antibacterial peptide)是基因编码的肽类抗菌分子,它们广泛存在于生物体内,是脊椎动物、无脊椎动物和植物的先天性免疫关键因子。长期以来,国内外对抗菌肽的研究主要集中在高等动物和一些低等昆虫方面,海洋抗菌肽研究是10年来发展起来的一个热点。本论文以我国重要海水养殖动物——栉孔扇贝和皱纹盘鲍为研究对象,开展抗菌肽的研究,取得了以下结果: (1)本文利用固相提取和HPLC技术,结合灵敏的酶标抗微生物活性检测法,从栉孔扇贝血液中纯化出1种抗菌肽。经测定其分子量为2000Da,部分氨基酸序列为GQPGHTGNAH……。 (2)从作者所在实验室构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中,筛选得到了鲍防御素基因EST。通过序列分析,发现该基因cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成。该前体的成熟肽含42个氨基酸,推测分子量为4323Da、等电点为8.02。氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性最高、达到了70%。因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,作者认为该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,并将其命名为鲍防御素(hd-def)。 (3)用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达,且鳗弧菌刺激引起的表达量比金黄色葡萄球菌诱导的高,说明该防御素基因属于诱导型表达。在被检测的5种组织中,hd-def基因仅在肝胰腺中表达,而在其它组织(性腺、鳃、肌肉和外套膜)中均未检测到表达。说明该基因具有明显的组织表达特异。 人工感染刺激后,不同时间皱纹盘鲍的hd-def表达量有很大差异。感染早期(2hr)表达非常微弱,4hr时表达量明显增大,感染中晚期(12hr)表达量最大。该结果提示,hd-def基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染。 (4)采用基因组步移法,获得了4032bp的全长基因组序列。分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497、2357和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中,这种是一种防御素基因的新结构模式,在其他昆虫防御素均未报道。 (5)本文利用酵母表达系统,成功构建鲍hd-def基因的重组表达载体pPIC9k-hddef。重组酵母体外表达4.3kd蛋白,具有抗鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的活性。