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克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析

董超华  
【摘要】: 模式识别受体(Pattern recognition receptor, PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质,它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associated molecular pattern, PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了RNA干扰技术,并利用新建立RNA干扰技术结合基因原核重组、荧光定量PCR等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白基因以及C-型凝集素基因进行了研究。 首先,通过体外转录合成目标基因的双链RNA,将双链RNA注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体,建立了稳定RNA干扰技术,能够有效沉默目标基因的表达。而且,这种RNA干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生,至少持续96小时,能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后,利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因:脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为PcLGBP)和C-型凝集素基因(命名为PcLEC)。 PcLGBP基因cDNA全序列包含一个1107bp的开放阅读框(Open reading frame, ORF),编码369个氨基酸。在N末端有一个17个氨基酸的信号肽,表明PcLGBP是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个β-1,3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD 106-108, 157-159)和一个N糖基化位点(NRSI 66-69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现PcLGBP与甲壳类动物的脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白LGBP(Lipopolysaccharide andβ-1,3-glucan binding protein, LGBP)或β-1,3葡聚糖结合蛋白(β-1,3-glucan binding protein, BGBP)同源,与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein, GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于40%。为分析PcLGBP基因的功能,通过半定量RT-PCR方法研究了其在组织中的分布,并用荧光定量PCR技术分析了其对细菌刺激的响应,结果表明PcLGBP基因是肝胰腺特异表达的基因,能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达,说明PcLGBP基因可能参与螯虾的细菌防御反应。利用酶联免疫法对重组PcLGBP蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定,表明重组PcLGBP蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的β-1,3-葡聚糖结合,而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解PcLGBP基因在细菌防御中的作用,利用RNA干扰技术沉默PcLGBP基因的表达,并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力,而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC基因的cDNA全序列包含一个813bp的ORF,编码271个氨基酸,在N末端有一个17个氨基酸的信号肽,以及一段富含甘基酸的序列,在C末端有一个糖识别结构域(Carbohydrate recognition domain, CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基,可能参与形成两对链内二硫键。PcLEC同甲壳动物、昆虫等物种的C型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明,PcLEC与经典的半乳糖结合C-型凝集素具有相似的空间结构,有七个β折叠,2个α螺旋共九个二级结构元件,有两对二硫键和一个长环状结构,是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR技术对PcLEC基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到PcLEC基因的表达,其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高,而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时,热致死的细菌注射能显著增强PcLEC基因的表达。对重组PcLEC蛋白进行凝菌实验表明重组PcLEC对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖Ca2+的凝集效应,这种凝集效应能够被半乳糖和N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了PcLEC对半乳糖和N-乙酰半乳糖胺具有较强的结合活性。 本研究的结果表明PcLGBP和PcLEC分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和C型凝集素家族的两个模式识别受体。PcLGBP基因是肝胰腺特异表达的基因,PcLEC基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达,在血细胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及β-1,3-葡聚糖结合,介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC蛋白能够与半乳糖及其衍生物N-乙酰半乳糖胺结合,以钙离子依赖的方式凝集细菌。


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