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刺参(Apostichopus Japonicus)体腔细胞原代培养技术的建立及其在快速筛选免疫增强剂中的应用

许乐乐  
【摘要】: 本文以我国重要的海水养殖动物刺参(Apostichopus japonicus)为研究对象,探索了刺参体腔细胞的体外原代培养技术,并用细菌细胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对离体培养条件下的刺参体腔细胞进行刺激,通过检测细胞一系列免疫酶活性,和吞噬能力,呼吸爆发等免疫指标的变化,建立了刺参体腔细胞免疫能力的评价方法。然后使用潜在的免疫增强物质壳寡糖(chitooligosaccharide,COS)体外刺激体腔细胞,证明了壳寡糖对刺参体腔细胞具有免疫促进效果。养殖实验证明壳寡糖也能够在个体水平上有效地提高刺参的免疫能力,提示壳寡糖可作为一种新型的刺参免疫增强剂进行开发。同时证实了体内体外实验的结果有良好的一致性,为将来在体外高通量大规模地筛选刺参免疫增强剂打下了基础。主要研究结果如下: 1.使用营养成分由低到高的三种培养液,CCM (成分为0.5 M NaCl,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA,20 mM HEPES,葡萄糖0.6 g/l ,1 g/l蛋白胨, 50 units/ml青霉素, 50μg/ml链霉素,pH 7.6),HSM [成分为31 g/l NaCl,10 mM Hepes,10 mg/l酚红,10% (vol/vol) Minimum Essential Medium (MEM),1 g/l蛋白胨,50 units/ml青霉素, 50μg/ml链霉素,pH 7.6],L-15N (主要成分为Leibovitz’s L-15细胞培养液,补充加入23 g/l NaCl,青链抗生素和硫酸庆大霉素50μg/ml,pH 7.6 ),对刺参的体腔细胞进行了体外培养,并使用MTT还原方法对细胞在体外的存活力进行了测定。结果显示,以CCM和HSM培养液培养的体腔细胞,在体外2日和5日后细胞活性明显下降。L-15N培养液则能够维持细胞活性,1周内保持稳定。重点观察并记录了刺参6类体腔细胞的两种主要免疫细胞,球状细胞和吞噬细胞的形态。刺参体腔液的渗透压等同于其生活的海水,然而其PH值略低于海水。发现刺参体腔液中存在着细菌。本实验结果可为以后开展其他棘皮动物的体腔细胞体外培养工作提供技术指导,即1,弄清体腔液的各种理化因子和特性,2,满足体腔细胞的营养需求。 2.使用脂多糖对体外原代培养的刺参体腔细胞进行免疫刺激。脂多糖刺激浓度为0,0.5,5,20μg/ml,分别于刺激后1 h,3 h,6 h,12 h,18 h,24 h,48 h取样,测定了细胞中3种免疫酶,酸性磷酸酶(ACP),总一氧化氮合酶(T-NOS),超氧化物歧化酶(T-SOD),和吞噬指数,呼吸爆发的活性变化情况。实验结果显示,脂多糖的刺激,显著提高了细胞的吞噬指数,呼吸爆发和T-NOS,T-SOD两种酶的活性(P0.05),但却对ACP的活性变化几乎没有影响。双因素方差分析显示海参体腔细胞的T-NOS和呼吸爆发同时受到脂多糖处理时间的影响,并且脂多糖刺激浓度和处理时间之间存在着显著的相互作用(P0.05)。因此,T-NOS,T-SOD,呼吸爆发和吞噬活性,这四个指标均可作为衡量在体外原代培养的刺参体腔细胞免疫状况的敏感免疫指标。建立了刺参体腔细胞的免疫评价方法,为在体外应用细胞培养技术,快速验证潜在的免疫增强剂对刺参体腔细胞的免疫提升效果,并最终开展实际养殖实验奠定了基础。 3.使用壳寡糖对体外原代培养的刺参体腔细胞进行免疫刺激。壳寡糖刺激浓度为0,40,60,80,120μg/ml,分别于刺激后1 h,3 h,6 h,12 h, 24 h取样,测定了细胞中3种免疫酶,酸性磷酸酶(ACP),总一氧化氮合酶(T-NOS),超氧化物歧化酶(T-SOD),和吞噬指数,呼吸爆发的活性变化情况。实验结果显示,壳寡糖的刺激,均在不同程度上显著提升了细胞的吞噬指数,呼吸爆发和T-NOS,T-SOD,ACP三种免疫酶的活性(P0.05)。壳寡糖能够在体外显著提升刺参主要免疫细胞体腔细胞的免疫力,提示其可能可以作为一种新型的免疫增强剂,应用到刺参的实际养殖实验中去。 4.研究了在饲料中添加壳寡糖对刺参生长和免疫状况的影响。壳寡糖的添加量分别为0(对照),100 mg/kg(低浓度),250 mg/kg(中浓度),600 mg/kg(高浓度)。每处理3个重复。刺参起始体重为7.9±0.02 g,室内静水充气养殖,以25个/桶的密度饲养于70-L的水桶中。每日傍晚吸底清污一次并投喂稍微过量的饲料,饲养8周。结果表明当饲料中添加600 mg/kg的壳寡糖时刺参的增重率,体腔细胞密度和总一氧化氮合酶水平显著高于对照组和中、低添加量组(P0.05)。饲料中添加壳寡糖能显著提高刺参体腔细胞的呼吸爆发活力,而且中、高浓度的壳寡糖(250和600 mg/kg)显著提高了刺参体腔细胞的吞噬活性和超氧化物歧化酶水平(P0.05)。饲料中添加壳寡糖对刺参体腔细胞内酸性磷酸酶活性并无显著影响;攻毒实验表明,添加高浓度600 mg/kg的壳寡糖可以显著降低灿烂弧菌(Vibro splendidus)对刺参的累计死亡率,而中、低添加量组与对照无显著差异。综上所述,为提高刺参的免疫力和促进生长,饲料中壳寡糖的适宜添加量为600 mg/kg。壳寡糖在体外和体内两种条件下均能有效地提升刺参体腔细胞和个体水平的免疫能力。 结论:实验初步证实了,借助原代培养的刺参体腔细胞这个平台,在体外筛选刺参用免疫增强剂是可行的。用脂多糖建立了体腔细胞的免疫评价方法,对潜在的免疫增强物质壳寡糖进行了快速筛选,验证了其对体腔细胞的免疫促进效果。养殖实验显示壳寡糖也能够在个体水平上有效地提高刺参的免疫能力,证实了体内体外实验的结果有良好的一致性。这样,在体外经济快速地筛选刺参免疫增强剂,加快高效免疫增强剂的研发并实现产业化,对刺参养殖业乃至我国水产养殖业健康可持续发展,将具有重要的经济价值和应用前景。


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