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增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用

杨晓燕  
【摘要】: 本文将化学发光传感技术、纳米技术相结合,探索构建了高灵敏度化学发光免疫传感器的新方法。基于化学发光、光谱学、电化学等手段对构筑的免疫传感器性能进行研究及优化。金纳米粒子作为固相载体,增加酶标抗体(或抗体)在固体表面的固定量,利用新型化学发光增强剂放大化学发光信号,提高化学发光免疫传感器的灵敏度。结果表明,所建立的检测方法灵敏度高,易制作、简便,在生物分析中将具有广阔的应用前景。 本文主要开展了以下几个方面的工作: 一、Luminol-H_2O_2-HRP-4-(1, 2, 4-三氮唑-1-基)苯酚增强化学发光新体系的研究及其应用 研究了一种新型酚类衍生物4-(1,2,4-三氮唑-1-基)苯酚(TRP)对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光体系的增强作用。结果表明TRP可以作为化学发光体系Luminol-H_2O_2-HRP的增强剂。建立了一种增强化学发光新体系Luminol-H_2O_2-HRP-TRP,并对新体系的各项影响因素进行了优化。在最佳实验条件下,对游离HRP进行了测定,测定游离HRP的线性范围为8.0×10~(-10) g/mL ~ 5.0×10~(-8) g/mL,检测限为5.0×10~(-10) g/mL。与经典增强剂对碘苯酚(PIP)相比,TRP增强的化学发光强度相对要高,发光时间更长。对Luminol-H_2O_2-HRP-TRP增强化学发光体系的机理进行了讨论。利用Luminol-H_2O_2-HRP-TRP增强化学发光体系并结合磁性微球技术对H_2O_2进行了测定。研究表明,磁性微球作为固相载体固定HRP时,本体系对H_2O_2测定的线性范围为2.0×10~(-6) mol/L ~ 1.0×10~(-3)mol/L,检测限为2.0×10~(-6) mol/L。 二、Luminol-H_2O_2-HRP-p-[1,2,4]-三氮唑基苯酚磷酸单酯预增强化学发光新体系的研究 利用三氯氧磷法制备了p-[1,2,4]-三氮唑基苯酚磷酸单酯(TAPM)。在碱性磷酸酯酶(ALP)催化水解下,TAPM对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光体系具有明显的预增强作用。考察了这一预增强发光体系中,影响发光强度的各种因素。建立了Luminol-H_2O_2-HRP-TAPM-ALP发光体系测定ALP的化学发光新方法。该方法测定ALP的检出限可达1.0μg/L(S/N=3),ALP浓度在1.0μg/L ~ 100μg/L范围内与化学发光强度呈良好的线性相应关系。 三、Luminol-H_2O_2-HRP-4-羟基-4′-碘-联苯(IPP)增强化学发光新体系的研究及其应用 研究了一种对位具有活性取代基的酚类化合物4-羟基-4′-碘-联苯(IPP)对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光体系的增强作用。建立了新型增强化学发光体系Luminol-H_2O_2-HRP-IPP,并对体系的各影响因素进行了优化,确定了反应的最佳条件。在最佳实验条件下,对游离HRP进行了测定,测定游离HRP的线性范围为5.0×10~(-11) g/mL ~ 4.0×10~(-8) g/mL,检测限为9.0×10~(-12) g/mL。研究表明IPP的增强效果优于经典增强剂对碘苯酚(PIP)。对Luminol-H_2O_2-HRP-IPP增强化学发光体系的机理进行了讨论。并利用Luminol-H_2O_2-HRP-IPP增强化学发光酶联免疫分析新体系,采用双抗体夹心法,结合免疫磁性微球分离和化学发光分析技术建立了血清中AFP含量的测定方法。该方法操作简单、快速,对AFP测定的线性范围为0.5 ng/mL ~ 5.0 ng/mL,检测限为0.5 ng/mL,比酶联免疫吸附测定光度法(ELSA)低。用所建立的方法对病人血清样品进行了测定,并与ELISA法进行了对照,二者相关性良好。 四、Luminol-H_2O_2-HRP-溴酚兰增强新化学发光体系的研究及其应用 研究了一种新型化学发光增强剂溴酚兰(BPB)对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光反应的增强作用。建立了新型增强化学发光体系Luminol-H_2O_2-HRP-BPB,并对体系的各影响因素进行了优化,确定了反应的最佳条件。在最佳实验条件下,对游离HRP进行了测定,测定游离HRP的线性范围为5.0×10~(-11) g/mL ~ 1.0×10~(-9) g/mL,检测限为1.0×10~(-11) g/mL。对Luminol-H_2O_2-HRP-BPB增强化学发光体系的机理进行了讨论。利用Luminol-H_2O_2-HRP-BPB增强化学发光酶联免疫分析新体系,采用双抗体夹心法,结合免疫磁性微球分离和化学发光分析技术建立了血清中AFP含量的测定方法。该方法操作简单、快速,对AFP测定的线性范围为1.0 ng/mL ~ 50.0 ng/mL,检测限为0.2 ng/mL。用所建立的方法对病人血清样品进行了测定,并与ELISA法进行了对照,二者相关性良好。 五、基于金纳米粒子作固相载体的增强化学发光免疫传感器的研制 研究了以金纳米粒子作为酶标抗体的固相载体,利用静电吸附作用将HRP标记AFP抗体固定在其表面,结合磁性微球的高效分离技术,采用双抗体夹心法,建立了Luminol-H_2O_2-HRP-BPB测定AFP、Luminol-H_2O_2-HRP-IPP测定AFP的新型化学发光免疫传感器。二者对AFP测定的线性范围分别为0.1 ng/mL ~ 5.0 ng/mL,0.008 ng/mL ~ 0.3 ng/mL,检测限分别为0.01 ng/mL,5.0 pg/mL。以金纳米粒子作为固相载体,利用共价结合作用将发光底物鲁米诺和CEA抗体同时固定在其表面,结合磁性分离技术,采用双抗体夹心法,建立了一种新型的、简便的化学发光标记技术,研究了一种新型的Luminol-H_2O_2-HRP-IPP增强化学发光体系测定CEA的化学发光免疫传感器。对CEA测定的线性范围为0.5 ng/mL ~ 50.0 ng/mL,检测限为0.5 ng/mL。用所建立的方法对病人血清样品进行了测定,并与ELISA法进行了对照,二者相关性良好。


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