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DNA荧光生物传感器的制备及水溶性量子点在DNA分析中的应用研究

李全义  
【摘要】: 核酸是生命的遗传物质,人类许多遗传疾病与DNA碱基序列的变异有关,因此,建立高灵敏度、高选择性、简单、快速检测特定序列DNA的分析方法,对疾病诊断和预防具有重要的意义。量子点具有优异的光学性质,与传统的有机染料相比,量子点具有激发光谱宽,发射光谱可调、发射峰较窄,斯托克斯位移较大和不易光解等优点,己在生命分析中得到广泛的应用。本论文主要分为以下四个部分: (1)处理过的光纤为探针固载基质,以酶催化底物放大杂交信号为检测方法,制备了一种新型的DNA荧光生物传感器。在光纤端面,DNA探针与生物素修饰的靶DNA杂交形成双链DNA,再共价接入亲和素修饰的辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)。通过检测酶催化产物联二对羟基苯乙酸(DBDA)的荧光强度,进行定量检测靶DNA。实验结果表明,检测DNA的线性范围为1.69-169 pM,检测限为1 pM(S/N=3)。用尿素溶液处理有利于传感器的再生,三次循环之后,传感器仍能保持70%的信号。 (2)直接合成水溶性CdSe和CdSe/ZnS量子点。针对有机相中合成量子点耗时、反应条件苛刻、非水溶性等问题,研究了以NaHSe为前躯体、巯基乙酸为稳定剂以及在无氧、搅拌等氛围下直接合成了水溶性量子点。同时研究了反应温度、时间、pH值、稳定剂及其用量等因素对量子点荧光的影响,使用透射电镜、荧光光谱法和紫外光谱法等对量子点进行了表征。实验结果表明,该方法能在简单的条件下快速合成稳定性好、荧光性能良好的CdSe和CdSe/ZnS量子点。以NaHTe为前躯体、巯基乙酸为稳定剂以及在无氧、搅拌等氛围下直接合成了水溶性CdTe量子点。用此法合成的量子点具有更窄的半峰宽,更加对称的发射峰和更高的量子产率。CdTe量子点放置三个月后量子产率达可达到45%,而且实验条件简便、成本低廉、可重复性强,因而是水相合成高质量量子点的一种较成功的方法。同时还具备制备具有近红外荧光量子点的可能性,为量子点在生化分析领域的应用提供了更多的机会。 (3)基于切口酶和靶DNA循环,以CdTe量子点为荧光探针,磁珠为DNA探针固载和分离基质,发展了一种新型的、高灵敏度荧光检测DNA的方法。该方法具有很好的选择性,能够精确的区分单碱基错配DNA和靶DNA。在最佳实验条件下,该方法测定DNA的线性范围是5.0 fM到500 fM。除了具有很高的灵敏度和选择性,该方法还可以结合一些传统的检测方法及其外延技术,从而实现对核酸、核酸适体、RNA和金属离子的检测。该方法也可以用于核苷酸多态性(SNP)及混合分析,例如,选用不同粒径的量子点可同时检测一系列的DNA和蛋白质分子。 (4)基于Hg2+可以嵌插到DNA的T-T错配碱基中形成T-Hg2+-T桥和单链DNA与SWNTs对靶DNA的竞争结合作用,建立了一种方便、快捷、灵敏的荧光检测Hg2+的方法。在最佳实验条件下,该体系测定Hg2+的线性范围是4.52×10-8 -7.21×10-7 M,检测限可达到0.1 nM,并具有良好的选择性。


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