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韧带成纤维细胞成骨分化过程microRNA、mRNA和蛋白表达谱分析

张秀梅  
【摘要】:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性进行性炎症疾病,是脊柱关节病(spondyloarthritides,SpA)的一种,主要侵犯脊椎关节与附近的肌腱、韧带等软组织,炎症后继发纤维化与钙化,使脊椎逐渐失去柔软度,严重时会发展到像“竹节”一样无法弯曲或伸展[1]。骶髂关节炎症和骶髂、脊柱关节强直是强直性脊柱炎典型的病理变化[1]。该病患者的病理特征性改变是韧带附着端病(enthesopathy),病变原发部位是韧带和关节囊等关节周围软组织[3]。而成纤维细胞是韧带的主要组成细胞,且成纤维细胞在BMP或者地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油的诱导下能够表达成骨细胞的表型。研究发现AS患者的韧带成纤维细胞能够表达成骨细胞表型物,如碱性磷酸酶,骨钙素等,并能够形成矿化结节,具有强烈的成骨能力[38, 40]。因此我们有理由认为,韧带成纤维细胞在强直性脊柱炎的骨化过程中发挥着重要的作用。目前这种观点为国内大部分学者所接受,但国外未见相关报道。 本研究取强直性脊柱炎患者的韧带,原代培养韧带成纤维细胞,以腰椎滑脱韧带成纤维细胞作为对照,用含地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油的诱导培养液诱导韧带成纤维细胞向成骨细胞分化,发现到第14天成纤维细胞表达碱性磷酸酶,骨钙素,并能形成大量矿化结节,且AS患者的韧带成纤维细胞骨钙素的表达程度强于对照成纤维细胞。芯片检测韧带成纤维细胞向成骨细胞分化0天,7天,14天韧带成纤维细胞microRNA和mRNA表达谱的变化,数据分析发现,和未诱导前相比,miR-29b在正常韧带成纤维细胞成骨分化第7天上调1.73倍,在成骨分化第14天上调1.51倍,western blot实验发现TGFβ3在成骨分化过程中表达下调,与文献报道[8]的其在间充质细胞向成骨细胞分化过程中上调的结果一致,表明我们实验方法的可行性,表明TGFβ通过Smad3来降低Runx2蛋白的表达和活性或者通过Smurf来介导Runx2降解,从而抑制成骨分化过程[9]。miR-31*在强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞成骨分化过程第7天下调0.30倍,在成骨分化第14天下调0.06倍,在正常韧带成纤维细胞成骨分化第7天下调0.20倍,在成骨分化第14天下调0.13倍,表明miR-31*在韧带成纤维细胞成骨分化过程中发挥了重要的作用。qRT-PCR实验结果与芯片结果一致。通过软件分析我们找到miR-31*的靶基因为ACVR1、Smad1、SATB2等,western blot实验发现Smad1蛋白在韧带成纤维细胞成骨分化过程中表达上调,表明Smad1可能为miR-31*的靶基因。Smad1可以与Smad4结合形成复合体并转位至细胞核内与不同的DNA结合蛋白结合,包括共激活因子和抑制因子,引起下游BMP相关的基因转录,从而调控细胞的分化[15],表明其在韧带成纤维细胞成骨分化过程中发挥着重要的作用。 mRNAs表达谱数据分析发现,在强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞成骨分化过程中,和诱导前相比,WISP1、MGP和FGF7等表达上调,DKK1、ADRA2A和ADAMTS14等表达下调,正常韧带成纤维细胞成骨分化过程中,FOXF1、PRRG4和MAP4K4等表达增加,DKK1、ADRA2A和ADAMTS14等表达降低。和对照相比,AS患者的韧带成纤维细胞CBF1、PAPPA和IFI16等表达上调,IGFBP1、FPR1和PMAIP1等表达下调。GO分析发现这些差异表达的基因主要涉及BMPs、Wnt和Hedgehog信号通路及精氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸代谢途径。 蛋白表达谱分析发现差异表达的蛋白有肿瘤坏死因子α诱导的蛋白、NF-kappa-B抑制剂相互作用Ras样蛋白、Annexin A2和淋巴细胞侵入和转移诱导蛋白2等。其中,NF-kappa-B抑制剂相互作用Ras样蛋白能够促进炎症因子的表达,T淋巴瘤侵入和转移诱导的蛋白2表达上调会引起钙粘蛋白表达的升高,并会引起钙粘蛋白的重新分配。Annexin2是一种潜在的钙离子通道[54],在细胞成骨分化过程中,分化晚期会分泌基质小泡(matrix vesicles,MV),MV含有ALP、Annexin2和Annexin5,并且能够起始矿化过程。 在韧带成纤维细胞成骨分化过程中我们发现了大量不同表达的microRNA、mRNA和蛋白,为我们进一步阐明韧带成纤维细胞成骨分化机制奠定了基础。第一章韧带成纤维细胞的原代培养及诱导成骨分化 目的:原代培养强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞,并用含地塞米松、抗坏血酸和b-磷酸甘油的诱导培养液诱导其向成骨细胞分化。 方法:取强直性脊柱炎患者的韧带组织后,胶原酶消化法原代培养获得韧带成纤维细胞,取第三代细胞,用含地塞米松(10nM)、抗坏血酸(50μg/ml)和β-磷酸甘油(10mM)的诱导培养液诱导其向成骨细胞分化,碱性磷酸酶显色试剂盒观察碱性磷酸酶的表达情况,RT-PCR检测骨钙素,RUNX2的表达情况,茜素红染色观察矿化结节的形成情况。 结果:成功培养出强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞,经地塞米松、抗坏血酸和b-磷酸甘油的诱导,碱性磷酸酶显色试剂盒观察到基质成熟期碱性磷酸酶开始表达,RT-PCR检测到骨钙素,RUNX2的表达,茜素红染色观察到矿化结节的形成。 结论:成功培养出韧带成纤维细胞,并在诱导培养液的诱导下表达成骨细胞表型。 第二章韧带成纤维细胞成骨分化过程microRNA和mRNA表达谱的检测 目的:寻找强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞在成骨分化过程中差异表达的microRNA和mRNA。 方法:取诱导分化0天,7天,14天的韧带成纤维细胞,分别提取microRNA和mRNA,分别用CURYTM LNA芯片和NimbleGen芯片检测差异表达的microRNA和mRNA,生物信息学分析差异表达的microRNA和mRNA。 结果:与诱导前相比,强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞成骨分化过程第7天有130个microRNA和801个mRNA表达上调,679个microRNA和1527个mRNA表达下调;成骨分化第14天有306个microRNA和1153个mRNA表达上调,490个microRNA和1125个mRNA表达下调;和正常的韧带成纤维细胞相比,有61个microRNA和2537个mRNA表达上调,82个microRNA和1166个mRNA表达下调;其中,miR-1246在成骨分化第7天上调1.48倍,成骨分化第14天上调3.69倍;miR-31 *在成骨分化第7天下调0.30倍,在成骨分化第14天下调0.06倍。 结论:通过对韧带成纤维细胞进行microRNA和mRNA表达谱分析,我们找出了大量差异表达的microRNA和mRNA,数据初步分析发现差异表达的基因除涉及BMPs、Wnt、Hedgehog及Notch等信号通路,还存在其他差异表达显著的microRNA和mRNA未见其与间充质细胞成骨分化功能有关的报道,表明韧带成纤维细胞的成骨分化过程可能还存在新的机制,这为我们进一步研究成骨分化机制奠定了基础。 第三章韧带成纤维细胞成骨分化过程蛋白表达谱的分析 目的:寻找强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞在成骨分化过程中差异表达的蛋白。 方法:取诱导分化0天,7天,14天的强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞,提取总蛋白,双向电泳技术分离蛋白,质谱分析差异表达的蛋白。 结果:与诱导前相比,强直性脊柱炎患者的韧带成纤维细胞成骨分化过程第7天有10个蛋白表达上调,20个蛋白表达下调,成骨分化第14天有7个蛋白表达上调,23个蛋白表达下调。经质谱鉴定发现20个差别比较明显的点,经Mascot Search软件分析,发现差异表达的蛋白有肿瘤坏死因子α诱导的蛋白、NF-kappa-B抑制剂相互作用Ras样蛋白、Annexin A2和淋巴细胞侵入和转移诱导蛋白2等。 结论:通过对韧带成纤维细胞进行蛋白表达谱分析,我们发现了肿瘤坏死因子α诱导的蛋白、NF-kappa-B抑制剂相互作用Ras样蛋白和Splicing factor, proline- and glutamine-rich等蛋白表达下调,T淋巴细胞侵入和转移诱导蛋白2、Cysteine desulfurase和Poly(A) polymerase gamma等蛋白表达上调,为后续研究奠定了基础。 第四章miR-31*及miR-29b在成纤维细胞矿化中的变化及靶基因验证 目的:生物信息学分析找出差异表达的microRNA、mRNA和蛋白,qRT-PCR和western blot验证差异表达的microRNA和蛋白。 方法:利用Agilent Gene Spring GX11.0软件对差异表达的microRNA、mRNA进行生物信息学分析,microRNA和mRNA表达谱数据结合microRNA.org-targets and expression软件( http://www.microrna.org/ )及TargetScanHuman 5.1软件(http://www.targetscan.org/)预测差异表达microRNA的靶基因,并分别用qRT-PCR和western blot验证。 结果:和诱导前相比,韧带成纤维细胞成骨分化过程中miR-21、miR-125b、miR-432及miR-31*表达明显下调,miR-1246和miR-29b表达上调,qRT-PCR结果和芯片结果一致,通过western blot结果显示Smad1为miR-31*的靶基因,TGF-β3为miR-29b的靶基因。 结论: qRT-PCR结果和芯片结果一致,通过生物信息学软件预测及western blot实验我们证明Smad1为miR-31*的靶基因,TGF-β3为miR-29b的靶基因。


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