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MiRNA靶向STAT信号通路调控DC分化在URSA中的作用与机制

尹训强  
【摘要】:背景复发性自然流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)是指在妊娠20周内连续发生2次或2次以上的自然流产,是大约3%的生育夫妇发生的一种妊娠并发症。尽管各种病因被认为是RSA的危险因素,如生殖道解剖异常、子宫结构异常、父母染色体异常、内分泌和/或代谢紊乱、自身免疫异常和环境因素。然而,大约50%的RSA患者的致病因素仍未确定,因其病因未明,称为原因不明复发性自然流产(Unexplained RSA,URSA)。URSA严重影响育龄妇女的生殖健康,越来越多的证据表明,母胎免疫耐受机制在妊娠过程中扮演着重要的角色。母胎免疫耐受在URSA中的发病机制,已成为生殖免疫学研究的热点。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一种独特的抗原提呈细胞,位于先天免疫系统和适应性免疫系统之间的交界处。因此,他们关键地参与了适应性免疫反应的启动或抑制,并被认为是决定胎儿是否被容忍或排斥的关键因素。最新研究显示,除正向增强T细胞适应性免疫应答外,DC在调节T细胞增殖分化在诱导与维持免疫耐受中发挥重要作用。树突状细胞被认为能赋予胎儿-母体的耐受性,并在确保妊娠成功方面起至关重要的作用。目前,DC亚群分化在URSA中的作用尚不清楚,更缺乏调节DC亚群分化机制的研究。此方面的深入探究有望成为防治URSA的突破口。作为STATs家族的重要成员,信号转导与转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)3和5B(STAT3/5B),其在DC发育分化及功能调控中发挥着关键作用,其信号通路变化导致的DC亚群分化状态及功能改变参与了炎症、肿瘤、过敏等疾病的发生,但其在URSA中调控DC亚群分化的作用尚不清楚。此方面的深入探索有望进一步揭示URSA的发病机制,为治疗提供新的靶点与途径。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是近年来发现的广泛存在于真核生物中的一类长约19-24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,主要通过碱基互补配对结合到靶基因mRNA 3'UTR对其进行转录后调控并使其降解,或在翻译水平抑制靶基因蛋白翻译,实现对靶基因的调控,参与了广泛的生物和病理过程。越来越多的研究表明,miRNAs在人类血液、蜕膜、绒毛中大量表达,并且,miRNAs调控失调与RSA的发病机制密切相关。然而,尚不清楚miRNA通过靶向STAT3/5B信号通路调控DC亚群分化在URSA中的作用与机制,该领域的深入探索将从表观遗传调控的角度阐释URSA的发病机制。目的探讨STAT3/5B信号通路在URSA中调控DC亚群分化的作用及miRNA靶向调控机制,阐释URSA发病机制,将从表观遗传免疫角度为临床治疗的准确指导提供新的靶点和实验依据。方法收集正常妊娠和URSA患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和蜕膜组织,分为正常对照组和URSA组;用流式细胞术检测PBMC和蜕膜组织中DC亚群分化状态;q-PCR检测PBMC和蜕膜组织中STAT3、STAT5B及相关转录因子E_(2-2)、ID_2 mRNA表达水平变化;高通量miRNA基因芯片筛选正常对照组和URSA组PBMC中差异miRNAs;生物信息学软件预测调控STAT3和STAT5B的差异miRNAs;差异miRNAs的表达验证;检测差异miRNAs的表达调控对STAT3和STAT5B信号通路的影响;双荧光素酶报告基因实验确定差异miRNAs与STAT3和STAT5B结合位点。结果1.与正常对照组比,URSA组PBMC和蜕膜组织中pDC(CD11c~-CD123~+)比例明显降低(P0.05),cDC(CD11c~+CD123~-)比例明显升高(P0.05),提示DC亚群的变化在URSA中扮演着重要的角色。2.与正常对照组比,URSA组PBMC和蜕膜组织中STAT3和E_(2-2)-2 mRNA表达均显著降低(P0.05),STAT5B和ID_2 mRNA表达均显著升高(P0.05),提示STAT3和STAT5B信号通路在URSA中发挥重要作用。3.高通量miRNA基因芯片检测及生物信息学软件预测结果显示,miR-6875-5p与STAT3 mRNA 3'UTR具有互补结合位点;miR-23a-3p与STAT5B mRNA 3'UTR具有互补结合位点。4.q-PCR验证结果显示,URSA组PBMC和蜕膜组织中miR-6875-5p表达显著升高(P0.05);miR-23a-3p表达显著降低(P0.05)。5.相关性分析结果显示,miR-6875-5p与STAT3/E_(2-2)-2 mRNA表达呈显著负相关(P0.05);miR-23a-3p与STAT5B/ID_2 mRNA表达也呈显著负相关(P0.05)。6.上调miR-6875-5p表达能显著降低STAT3及E_(2-2)-2 mRNA水平(P0.05),同时显著降低STAT3总蛋白和磷酸化水平(P0.05);下调miR-6875-5p表达能显著升高STAT3及E_(2-2)-2 mRNA水平(P0.05),同时显著升高STAT3总蛋白和磷酸化水平(P0.05)。7.上调miR-23a-3p表达能显著降低STAT5B及ID_2 mRNA水平(P0.05),同时显著降低STAT5B总蛋白水平(P0.05);下调miR-23a-3p表达能显著升高STAT5B及ID_2 mRNA水平(P0.05),同时显著升高STAT5B总蛋白水平(P0.05)。8.双荧光素酶报告基因实验证实,miR-6875-5p通过碱基互补配对直接结合STAT3mRNA 3'UTR,miR-23a-3p通过碱基互补配对直接结合STAT5B mRNA 3'UTR。结论1.STAT信号通路可能通过调控DC亚群偏移(pDC比例降低、cDC比例升高)参与URSA的发生。2.miR-6875-5p表达升高抑制STAT3信号通路进而降低pDC亚群分化可能是URSA发生的重要原因。3.miR-23a-3p表达降低促进STAT5B信号通路进而增加cDC亚群分化可能是URSA发生的重要原因。4.miRNAs表观遗传免疫调控参与了URSA发生,靶向miRNAs调控STAT信号通路逆转DC亚群失衡可能成为防治URSA的有效靶点和途径。


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