分泌表达葡萄白藜芦醇合成酶工程菌的构建及发酵条件优化

【摘要】：白藜芦醇（Resveratrol，Res）是一种植物抗毒素（phytoalexin），属非黄酮类多酚化合物，广泛存在于多种植物中，其中中药虎杖和葡萄中的含量尤为丰富。近年来对白藜芦醇生理活性的研究表明：白藜芦醇对于人的身体健康具有很多的药理活性和保健功能，如抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗菌、免疫护肝、治疗心血管疾病、保护线粒体、保护神经作用等。目前，白藜芦醇的制取方法主要是天然植物提取法、植物细胞培养法和化学合成法，但他们都有各自的缺点，因此，利用基因工程的方法构建能够生产白藜芦醇的工程菌是提高植物中Res含量的可行途径之一。 本研究首先通过NCBI查询到葡萄中白藜芦醇合成酶基因的编码序列（ID:AB046375），并根据基因序列设计特异性引物，以葡萄cDNA作为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)技术特异性扩增出白藜芦醇合成酶基因，该基因序列大小为1179bp。将其克隆到大肠杆菌表达载体pET22b上，转入到大肠杆菌感受态DH5a中，获得克隆菌株DH5a-pET22b-RS，测序验证并保藏菌株。将质粒pET22b-RS转入大肠杆菌BL21（DE3）中，获得工程菌BL21-pET22b-RS，经IPTG诱导后，用SDS-PAGE电泳检测到42.9KDa重组蛋白，与报道相同。 接着对可用于发酵生产白藜芦醇的BL21-pET22b-RS重组菌株的发酵条件进行了研究。通过HPLC（高效液相色谱）检测白藜芦醇的方法，检测添加底物对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A经过发酵培养后得到的白藜芦醇产量，并通过对发酵条件的优化研究了一些重要因素对发酵的影响，确定了较为适合的白藜芦醇生产条件。结果表明：当种龄为12h，接种量为5%，诱导剂的浓度为0.1mM，培养温度为30℃，pH为6.5，选用的培养基为LB液体培养基，且甘油作为碳源，整个发酵过程的时间为24h，获得白藜芦醇的产量最高，可达25.21mg/L。 本研究成功的构建了带有白藜芦醇合成酶基因的工程菌BL21-pET22b-RS，并且优化了其发酵条件，为未来实现利用微生物生产白藜芦醇工业化、产业化打下了基础。