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谷氨酸发酵中生物素含量的测定及控制

刁立兰  
【摘要】: 本文分别采用微生物法、荧光法和高效液相色谱法对谷氨酸发酵原料中的生物素含量进行测定,以寻求一种简捷、快速、准确的生物素测定方法,为谷氨酸发酵生产中生物素的控制提供了可靠的理论依据,并深入探讨了生物素对谷氨酸发酵的影响以及发酵过程中生物素浓度的控制。 首先,利用微生物法测定生物素含量,添加不同浓度的生物素标准溶液到培养基中,摇床培养至菌体对数生长期,立即测吸光率。培养条件:培养基pH7.0;250mL三角瓶装液量为30mL;32℃、200r/min培养12h。以生物素浓度为横坐标,吸光率为纵坐标,绘制生物素标准曲线,线性回归方程:Y=0.1857X+0.0049,R2=0.9982。玉米浆、糖蜜和淀粉水解糖液样品稀释后添加到培养基中,培养12h,通过生物素标准曲线计算出对应的生物素含量。该法测得玉米浆、糖蜜和淀粉水解糖液中的生物素含量分别为927、2106和604μg/L。 其次,利用酶标仪进行荧光法测定生物素含量时对样品的处理和测定条件进行了探讨。玉米浆样品酸解:取一定量玉米浆样品,加入1.5倍体积的6mol/L的盐酸,121℃酸解100min;糖蜜样品酸解:取一定量糖蜜样品,加一倍体积的重蒸水和1.5倍体积的6mol/L的盐酸,121℃酸解100min。酸解后的样品及淀粉水解糖液样品4000r/min离心15min,上清液用1mol/L氢氧化钠调pH至7.5,再用pH7.5磷酸盐缓冲液定容。荧光法测定工作条件:激发波长为496nm,发射波长为516nm;缓冲液选用pH7.5的磷酸盐缓冲液;反应温度20℃以下;10min内完成测定。该法测得玉米浆、糖蜜和淀粉水解糖液中生物素的含量分别为940、2180和617μg/L。 再次,在高效液相色谱法测定生物素实验过程中,对玉米浆、糖蜜样品的脱色条件和测定的色谱条件进行了探讨。玉米浆、糖蜜样品处理:玉米浆120mL、糖蜜120mL(加120mL蒸馏水),分别加入180mL 6mol/L盐酸,121℃下酸解100min,酸解后的样品4000r/min离心15min,上清液调pH3.0,用活性炭脱色。活性碳脱色条件:pH3.0、80℃、30min。浓缩过滤:脱色后的样品及120mL淀粉水解糖液样品用旋转蒸发器分别浓缩至2-3mL,用0.45μm滤膜过滤后即可进行HPLC分析。色谱条件:Hypersil ODS (25μm,5.0mm×250mm)色谱柱;流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液;pH值为3.0;流速为1mL/min;紫外检测波长为210nm;进样量为30μL。该法测得玉米浆、糖蜜和淀粉水解糖液中的生物素含量分别为770、1950和610μg/L。 同时,通过摇瓶发酵实验探讨了生物素浓度对谷氨酸发酵的影响,确定了生物素的最佳初始浓度为2-5μg/L。生物素浓度在2μg/L时谷氨酸产率最高,可达64.36mg/mL;乳酸产量相对较低,为6.68mg/mL。


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