海藻糖合酶特性及固定化条件的研究

【摘要】： 海藻糖是一种安全的天然糖类,具有非还原性,保湿性,热酸稳定性,抗冻结、干燥性等特性,而且它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖在分子生物学、医学、食品工业、化妆品工业、农业等领域有着广阔的应用前景,但是海藻糖制取上的困难限制了它的广泛应用。本研究立足于利用海藻糖合酶酶法合成海藻糖,研究内容包括海藻糖合酶高产菌株恶臭假单胞菌P06的诱变选育,海藻糖合酶的分离纯化、酶学特性及酶的固定化条件的研究。 本课题以恶臭假单胞菌(本研究室保藏菌种Pseudomonas putida P06,简称P06)为出发菌株,经过紫外线与亚硝基胍复合诱变最终选育出一株海藻糖合酶高产突变株P06-3-5。与出发菌株相比,其产酶能力提高了1.25倍。突变株P06-3-5经10余代传代实验,具有良好的遗传稳定性。 海藻糖合酶属于胞内酶,自P06-3-5菌株破壁而得,粗酶经过Sephadex-G75和Sephadex-G200凝胶过滤柱后,通过SDS-PAGE电泳验证其纯度,得到两条亚基带,并测定它们分子量分别为55000Da和50000Da,并对其酶学特性进行了研究。 本研究首先对四种固定化载体的固定化效果进行考察,并对酶活和稳定性较好的固定化酶的固定化条件进行优化。确定戊二醛浓度为0.5%、液态酶与壳聚糖凝胶的配比为1:1、交联pH值为8.0、交联温度为15℃、交联时间为12h条件下,固定化海藻糖合酶的活性最高。 本研究还以细菌纤维素为载体,采用吸附-交联的方法将海藻糖合酶固定化,在最适固定化条件下,15℃吸附20h,然后与6%戊二醛在15℃交联20h。实验发现,与游离酶相比,固定化酶的最适pH值向碱性方向移动0.4,为pH7.4,最适作用温度为45℃,比游离海藻糖合酶提高5℃,酸碱稳定性、热稳定性均有较大提高;重复使用6次后,酶剩余活力保持在86%左右,有较好的操作稳定性和重复使用稳定性。 在细菌纤维素固定海藻糖合酶的条件下,本文对麦芽糖浓度、反应时间与反应温度等因素对麦芽糖转化率的影响进行了研究。结果表明:麦芽糖浓度对转化率影响很微弱;反应初期,温度越高,生成海藻糖的初始速度越快,但是到反应末期,反应速度减弱得也越快,转化率反而不是很高;固定化酶转化麦芽糖为海藻糖的最佳反应时间为18小时,这时可以获得最高含量的海藻糖。酶反应最适环境温度40℃,得到海藻糖浓度为52.76mg/mL。