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玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

李慧伦  
【摘要】:本课题根据已发表的玉米19kD醇溶蛋白基因ze19启动子(GenBank登录号为:X63667)的保守序列,采用PCR方法从玉米自交系9801中克隆了19kD醇溶蛋白基因启动子(GenBank登录号为:HQ014565),序列分析表明:该启动子全长为1425bp,与报道序列的同源性为94%,具有TATAbox和CAATbox等启动子基本元件,还具有GCN4、skn-1、prolamin box、-300element等参与调节玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式作用元件。 将克隆的zel9启动子,取代质粒PBI121中的CαMV35S启动子成功构建了由zel9启动子驱动GUS基因的植物表达载体pBIze19。利用液氮冻融法将重组质粒pBIze19转入土壤杆菌LBA4404中,通过土壤杆菌介导的方法对烟草进行了转化,对转化植株进行PCR检测。结果可以扩增到与目的片段大小一致的条带,对于PCR检测呈阳性的植株,进行Southern杂交分析,表明外源基因已经整合到烟草基因组中。为了检测启动子表达的组织特异性,对获得的阳性转基因植株通过GUS组织化学染色(以X-gluc为底物)和荧光分光光度计进行荧光检测分析(以MUG为底物)。结果表明,在转基因烟草种子中能观察到较深的GUS染色,而在其叶片中GUS着色很浅,在其茎中没有GUS着色,荧光检测也证明了GUS活性在种子中最高,达到了62.18nmol 4-MU/min.mg protein,而叶片中只有7.52nmol4-MU/min.mg protein,而在茎中活性为0。尽管在叶片中检测到了微弱的GUS活性,但与种子中的高活性相比较,所克隆的ze19启动子具有种子特异性表达特性。而利用CαMV35S启动子所做的对照表明,在转基因烟草种子、叶片和茎等组织中,均能检测到较高的GUS活性,表明CαMV35S启动子不是种子特异性表达的。该研究为玉米种子生物反应器的研究奠定了基础。


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