拟南芥种子特异表达基因启动子分析

【摘要】： 植物的种子与人类的生产生活关系非常密切,因此成为植物基因工程中进行改良的重要目标材料。转化的外源基因在植物受体组织中能否正确、高效并按照人们的意愿特异地表达是人们非常关注的问题。理想的转基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定时间内高水平表达,产生人们期望的表型性状。启动子在决定基因表达方面起关键作用。启动子是决定转录起始点和转录频率的关键元件。对启动子结构和功能的研究,不仅对研究基因表达调控的机理具有重要的理论意义,而且对利用基因工程方法改良作物具有重要的实践意义。启动子中除了含有基本启动子外还存在一些特异的顺式调节元件,这些顺式调节元件在基因的特异表达中发挥重要作用。种子特异启动子在上游存在某些特异元件调控种子特异基因表达。 目前在生物信息学的研究中,人们针对DNA序列数据和基因表达数据的知识挖掘,往往是分开单独进行的。然而,实际上基因的表达与其DNA序列中该基因的启动子序列是有直接联系的。通过对DNA序列和基因表达数据的综合考虑,有可能使人们在基因组水平上更深刻地认识基因表达和转录调控。 本实验以拟南芥为研究材料,利用芯片信息获取拟南芥中种子特异表达基因并对其启动子区域进行分析。验证芯片结果用于启动子研究的可靠性,我们主要采用启动子连报告基因转化拟南芥的方法观察启动子的时空表达模式,主要实验结果如下: 1、通过Genevestigator软件获取拟南芥种子特异表达基因,使用UniGene中EST模式去除数据中的假阳性基因,最后筛选出63个基因是在种子组织特异表达的。从TAIR网站获取这些基因启动子区域序列,用PlantCARE网站进行调控元件分析,大部分启动子区域含有种子特异元件。 2、分别对转有AT2G03520、AT3G22500、AT4G27530基因启动子序列驱动的gus报告基因的转基因拟南芥进行GUS染色,以及GUS活性测定发现启动子序列具有种子特异表达活性。 3、用实时定量PCR检测AT2G03520、AT3G22500、AT4G27530基因内源表达模式,符合芯片结果和GUS表达模式。从转录、翻译水平说明芯片数据可用于启动子表达的研究。 4、在启动子缺失实验中发现,AT2G03520启动子全长(-444 bp ~1 bp),缺失启动子2G△1(-322 bp ~1 bp)2G△2(-200 bp ~1bp)仍具有种子特异表达活性,缺失2G△3(-125 bp ~1 bp)后失去大部分活性;AT3G22500启动子全长(-664 bp ~30 bp)有活性,缺失启动子3G△1(-406 bp ~30 bp)失去活性;AT4G27530启动子全长(-812 bp ~-2 bp),缺失启动子4G△1(-615 bp ~-2 bp)仍有种子特异表达模式,4G△2(-418 bp ~-2 bp)、4G△3(-203 bp ~-2 bp)启动子特异性丧失。 5、用YMF、weedr、Bioprospector、Mobydick程序预测63个基因上游1000bp启动子区域,预测出RY基序、B-box、G-box等已知种子特异表达调控元件。说明将芯片表达数据、基因组序列信息、生物软件预测联合运用可以对具有相同表达模式的一类基因的启动子调控元件进行分析,获取有生物学意义的信息。