A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较

【摘要】： 过去十几年,ALV-J亚群病毒对肉用型鸡、蛋用型鸡和我国地方品系鸡的感染已经给养殖业造成了巨大经济损失。近两年,鸡白血病/血管瘤病例的显著上升使该病成为危害我国蛋鸡业的主要疫病之一。病毒分离鉴定表明,血管瘤的发生不仅由J亚群禽白血病病毒引起,同时也有由A、B亚群禽白血病病毒感染引起。为了调查我国不同品系鸡中外源性ALV的感染状况和病毒的致病特性,本研究分别从进口祖代白羽肉鸡、海蓝褐蛋鸡、中国某地方品系鸡采样接种DF-1细胞,分离到3株外源性ALV,依次为SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E1。另有本实验室从另一地方品系鸡分离到的外源性ALV,SDAU09E2,对这4个分离株进行了全基因组测序。选择毒株SDAU09C1和SDAU09C3分别接种白羽肉鸡、HN蛋鸡、SPF鸡的5日龄鸡胚,同时以ALV-J亚群病毒NX0101作为参照,比较了三株病毒对不同品种鸡的致病性。 1 A亚群禽白血病病毒的分离鉴定 240只直接进口祖代白羽肉鸡在洁净度105的SPF动物房饲养到7日龄时,分别无菌采集抗凝血;从某海蓝褐蛋鸡场现场采集30份抗凝血,从中国某地方品系鸡采集30枚鸡蛋,无菌条件下运送到本实验室。将样品适当处理后接种DF-1细胞,培养9d或14d后,取细胞培养上清用禽白血病病毒p27抗原检测试剂盒检测ALV p27抗原,抗原阳性上清再次感染空白DF-1细胞并扩大培养,再次测得p27抗原阳性样品即为分离到的外源性ALV。 2四株A亚群禽白血病病毒的序列分析 设计7对重叠引物,以病毒感染DF-1细胞基因组DNA为模板分别从4株外源性ALV的前病毒基因组DNA中扩增相应基因片段,PCR扩增产物经克隆、测序后,利用DNAStar软件将彼此重叠的核苷酸片段拼接,获得前病毒全基因组序列。并对各基因产物进行序列分析 2.1分离株gp85的序列比较 4个分离株的gp85基因大小不同,编码氨基酸序列与10株ALV-A亚群参考株的同源性均在87.7%以上,而与ALV-B、C、D、E亚群参考株的同源性仅在76.9%-85.5%之间,与ALV-J亚群参考株的同源性平均仅为38%左右。进化树分析也显示4个分离株与ALV-A亚群参考株的同源关系最近。这表明4个分离株均属于ALV-A亚群病毒。 2.2分离株gag和pol的序列比较 4个分离株的gag和pol大小与各亚群参考株一致,编码的氨基酸序列相对保守,与各亚群参考株的同源性分别在95.4%和97.3%以上。 2.3分离株gp37的序列比较 4个分离株的gp37基因大小不同,编码氨基酸序列均与内源性病毒ev-6的同源性最高,在92.1%-95.9%之间。 2.4分离株LTR区的序列比较 4个分离株的LTR大小不同,其中SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2三株LTR大小与外源性ALV参考株一致,序列同源性在85-90.7%之间,而与内源性病毒参考株的序列同源性最高只有70%。但SDAU09E1株LTR大小与内源性病毒参考株一致,核苷酸序列与内源性病毒参考株和美国报道的疫苗污染株PDRC-1039、PDRC-3246、PDRC-3249的同源性最高,在91.3-93.5%之间,而与外源性病毒参考株的同源性平均仅为66%。 2.5分离株U3区的序列比较 在LTR序列内的U3区,分离株SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2与内源性参考株和3个疫苗污染株的同源性平均仅为51%,而与外源性病毒参考株的同源性在82.4-92.5%之间;分离株SDAU09E1与内源性病毒参考株和3个疫苗污染毒株的同源性在82.7%-97.5%之间,而与外源性病毒参考株的同源性小于50%。序列分析表明,SDAU09E1的U3区主要转录调控元件与外源性病毒参考株一致,而其它3个分离株的U3区主要转录调控元件与外源性病毒参考株一致。这表明,SDAU09E1基因组中带有内源性病毒LTR序列,SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2的LTR区属于外源性病毒序列。 3四株A亚群禽白血病病毒在细胞上的复制水平比较 将4株分离毒等量接种DF-1细胞,p27抗原ELISA检测结果显示,SDAU09E2在DF-1细胞上的复制速度最快,SDAU09C1次之,SDAU09C3低于SDAU09C1,而SDAU09E1复制很慢。病毒滴度检测结果显示,相同条件下,SDAU09C1的TCID50最高,SDAU09E2次之,SDAU09C3低于SDAU09E2,而SDAU09E1的TCID50值显著低于其它3株病毒(最小相差100倍)。4株分离毒在DF-1细胞上复制水平的差异可能与它们U3区启动子活性密切相关。 4不同毒株的致病性比较 4.1 SDAU09E1和SDAU09C1的感染性比较用SDAU09E1和SDAU09C1等量腹腔注射1日龄SPF鸡的实验结果显示, SDAU09C1攻毒鸡产生了免疫耐受,持续泄殖腔p27抗原阳性,没有产生抗体反应,且横向传播能力较强。SDAU09E1攻毒鸡仅表现一过性病毒血症,抗体反应很慢,没有发生横向感染。这表明带有内源性LTR特别是U3序列的病毒SDAU09E1对SPF鸡的感染能力显著低于病毒SDAU09C1。 4.2 SDAU09C1和SDAU09C3对白羽肉鸡、蛋鸡、SPF鸡的不同类型致病性比较选择分离株SDAU09C1和SDAU09C3分别接种白羽肉鸡、HN蛋鸡、SPF鸡的5日龄鸡胚,同时以本实验室分离的ALV-J亚群毒株NX0101作为对照,比较三株病毒对不同品种鸡的致病性。 4.2.1三株ALV对不同品种鸡的致肿瘤性 对自然死亡鸡的解剖发现,在20w-27w内,SDAU09C1和SDAU09C感染的白羽肉鸡分别出现1例肿瘤病例,NX0101感染的白羽肉鸡分别出现2例肿瘤病例;SDAU09C1感染的HN蛋鸡出现1例肿瘤病例,NX0101和SDAU09C3感染的HN蛋鸡均没有出现肿瘤;SDAU09C1感染的SPF鸡有4只表现为骨硬化,1只表现为肾脏肿大和肝萎缩,SDAU09C3感染的SPF鸡有1只表现为骨硬化,NX0101感染的SPF鸡出现3只肿瘤病例。而且肿瘤类型表现比较复杂。3株ALV感染不同品种鸡肿瘤类型的多样化及致肿瘤数的差异可能与病毒特性、宿主的遗传背景及宿主的个体差异有关。 4.2.2三株ALV对不同品种鸡免疫水平的影响 三株ALV感染3个品种鸡在第6w时测得脾脏与体重比、胸腺与体重比、法氏囊与体重比在统计学水平上没有发生显著变化(P0.05),而三株ALV感染的不同品种鸡针对NDV、AIV-H9、AIV-H5疫苗免疫产生了不同程度的免疫抑制。 4.2.3三株ALV对不同品种鸡的感染性比较 病毒血症、泄殖腔p27抗原和血清抗体的检测结果显示,NX0101鸡胚接种在白羽肉鸡产生的感染程度比在HN蛋鸡严重,与SPF鸡水平相当,但在白羽肉鸡中的横向传播水平较高,在HN蛋鸡和SPF鸡中的横向传播能力较弱。SDAU09C1鸡胚接种在部分SPF鸡产生了免疫耐受,而且横向传播水平较高,在白羽肉鸡仅诱导产生一过性病毒血症,横向传播水平较低,在HN蛋鸡引起的感染程度介于白羽肉鸡和SPF鸡之间,但可以产生较高水平的横向传播。SDAU09C3接种SPF鸡胚引起耐受性病毒血症,横向传播水平较高,接种HN蛋鸡鸡胚产生的感染程度和横向传播水平低于SPF鸡,接种白羽肉鸡鸡胚产生的感染和横向传播能力都很低。这表明NX0101对白羽肉鸡和SPF鸡的感染性最高,SDAU09C1和SDAU09C3对SPF鸡和HN蛋鸡的感染程度高于对白羽肉鸡。而且在SPF鸡,三株病毒产生的感染程度为SDAU09C3 SDAU09C1NX0101;在HN蛋鸡,为SDAU09C1 SDAU09C3NX0101;在白羽肉鸡,为NX0101 SDAU09C1SDAU09C3。 4.2.4三株ALV对不同品种鸡的其它致病类型比较 三株ALV感染3个品种鸡在生长发育上表现出不同程度的抑制,病毒NX0101感染白羽肉鸡的体重水平最低,病毒SDAU09C3感染HN蛋鸡的体重水平最低,病毒SDAU09C1和NX0101感染SPF鸡体重水平低于病毒SDAU09C3感染的SPF鸡。血常规分析显示,三株ALV感染不同品种鸡的血液白细胞数和淋巴细胞数在1w-15w没有发生显著变化(P0.05)。但在第21w时,SDAU09C1和SDAU09C3感染白羽肉鸡的白细胞数和淋巴细胞数显著高于对照组(P0.05);SDAU09C3和NX0101感染SPF鸡的白细胞数和淋巴细胞数显著高于对照组(P0.05);NX0101感染HN蛋鸡的白细胞数和淋巴细胞数显著低于对照组(P0.05)。 本研究通过病毒分离和基因组测序为了解我国鸡群中经典外源性ALV的流行状况和遗传进化关系提供了新的依据。ALV主要引起感染鸡的肿瘤发生和免疫抑制,本研究通过比较不同ALV分离株对不同品种鸡的致病性,对禽白血病的有效防制提供了重要的参考价值。