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嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究

郭晓红  
【摘要】: 脂肪酶(EC 3.1.1.3),全称三酰甘油酰基水解酶,广泛存在于生物体内。微生物来源的脂肪酶由于种类多、生长周期短、易于培养等特点而被广泛用于工业生产。脂肪酶能够催化油脂中甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。但一般的脂肪酶热稳定性较差,在应用中易于失活,因此热稳定性脂肪酶的研究和开发具有重要的商业价值。对于热稳定脂肪酶性质和结构的研究已经成为当前脂肪酶研究的热点问题。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种生长上限温度较高的嗜热真菌,它能够产生具有重要工业价值的热稳定脂肪酶。但是野生菌产酶存在培养温度高等较多不利因素,因而近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,进而获得稳定表达的热稳定脂肪酶。 本研究在添加橄榄油的诱导培养基上诱导C. thermophilum产生脂肪酶,根据已报道的脂肪酶同源保守序列设计兼并引物,综合运用RT-PCR、3’RACE、Tail-PCR技术克隆到脂肪酶基因的全长序列,命名为lm,其中DNA序列长1180bp,有4个内含子;cDNA序列长870bp,开放阅读框编码290个氨基酸,序列提交GenBank,登录号分别为GU338249和GU338248。 将脂肪酶基因lm编码区与酵母分泌型表达载体pPIC9K经过EcoR I和Not I双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/lm。将重组表达质粒pPIC9K/lm用限制性内切酶Sac I线性化,电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子目的蛋白表达情况,筛选到表达活性最高的菌株GS-LM-18,在第六天酶的活性最高,达19.77 U/mg,蛋白表达量为0.428 mg/mL。 酵母工程菌株GS-LM-18在YPD平板上划线连续传代10次后,重组脂肪酶的表达量基本保持稳定。表达脂肪酶LM的最适反应温度和pH分别为60℃和10.0,该酶在60℃以下稳定,70℃的半衰期为40min,在pH值为9.0~11.0之间表达脂肪酶保持稳定的酶活性;Ca~(2+)对酶有明显的激活作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、K~+、Ag~+对酶有显著的抑制作用。 重组脂肪酶工程菌能分泌出具生物活性的脂肪酶,而且表达脂肪酶具有热稳定性,预示了表达的脂肪酶在生物学领域和化工工业的广阔应用前景。


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