禽白血病病毒J亚群、B亚群的分离鉴定及核酸探针的制备

【摘要】： 禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。禽白血病病毒群分为A、B、C、D、E、J等共10亚群。近年来,J亚群禽白血病在我国呈流行性爆发,对我国养禽业造成巨大的经济损失。目前,国内外尚无有效的疫苗和药物用于防治本病。世界各国控制禽白血病的主要措施是通过病原检测,淘汰阳性鸡,从而净化种群消灭本病。但由于禽白血病毒gp85基因极易发生抗原变动,现有ALV抗体检测试剂盒不能保证检测到所有中国株ALV抗体。基于此,建立适合我国ALV感染的快速诊断方法显得尤为必要。 本实验通过血清学ELISA、病理学以及病毒分离,获得ALV-B和ALV-J各两株分离株,并在国内首次从感染ALV-J的海蓝白商品蛋鸡群中分离到B亚群禽白血病病毒(ALV-B),同时证实了ALV-B、ALV-J在同一鸡只体内的混合感染。对该鸡场血清样品(92份)ELISA检测显示:ALV-A/B型抗体阳性率为16.3%,ALV-J抗体阳性率为13%,其中有1只鸡呈现抗体双阳性;病理组织学观察显示,在肝脏同一位置发现淋巴细胞样瘤细胞和髓细胞样瘤细胞增生灶,其它组织器官(除脑、神经和法氏囊)也有不同程度的两种瘤细胞增生;合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特异性引物进行PCR检测,获得1100bp的ALV-B特异性片段和924bp的ALV-J特异性片段,而MDV和REV检测为阴性。在同一只鸡中出现ALV-B和ALV-J双阳性,分离得到ALV-B和ALV-J各两毒株;对ALV-B、ALV-J扩增序列进行遗传进化树分析表明,两ALV-B分离株与其代表株的同源性分别为92.8%和93.0%;两ALV-J分离株与英国原型株同源性分别为96.9%和91.5%,与美国原型株同源性为85.9%和81.5%,与国内分离毒株同源性在87.0%～98.7%之间。 基于ALV群内混合感染的出现,制备了通用探针和ALV-J核酸探针,运用斑点杂交方法对禽白血病B、J亚群和马立克氏病、网状内皮增生症进行检测诊断。根据GenBank中已经发表的ALV各亚群基因的序列,筛选比较各亚群gag基因和env囊膜基因,直接合成核酸探针的目的片段,利用随机引物法标记物地高辛(DIG)制备了ALV通用核酸探针和J亚群核酸探针;通过斑点杂交检测方法对此探针特异性进行验证,检测结果显示:该探针能与标准毒株ALV核酸发生特异性杂交,而与对照的未接毒DNA、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)核酸杂交反应为阴性,具有良好的特异性。特异性核酸探针的制备为我国ALV感染的快速诊断提供了新的思路和方法。