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基于功能树状高分子修饰电极快速检测禽流感病毒的研究

朱向彬  
【摘要】: DNA电化学生物传感器是用电化学手段进行DNA结构分析和检测的生物传感器,具有高度的分子识别功能、准确性好、灵敏度高、易于集成化和自动化等优点,特别适用于表面过程、修饰电极、电子转移过程等的研究,已经广泛应用在基因诊断、传染病检测、基因表达检测、法医学和环境监控等领域中。在传感器的构建过程中,如何有效利用生物分子的固定技术及选择合适的固定材料决定着DNA电化学生物传感器的稳定性、选择性和灵敏性等主要性能。本论文探讨设计了三种新型的电化学生物传感器,根据鸟嘌呤G氧化信号的变化来初步检测禽流感病毒DNA的固定与杂交的方法,使用循环伏安法、示差脉冲伏安法和电化学阻抗谱对其进行表征,并对DNA电化学生物传感器在禽流感病毒检测中的应用进行了研究。研究内容主要分为以下三部分: (1)利用铁氰化钴-树状高分子(CoHCF-PAMAM)复合材料修饰玻碳电极(GCE),制备了免标记检测基因突变的新型DNA电化学传感器。传感器中树状高分子层明显增加了单链DNA探针的固定量,铁氰化钴层增大了鸟嘌呤的氧化信号,该传感器可以灵敏识别单碱基错配的基因序列,具有良好的选择性和灵敏度。在7.6×10~(-11)~3.05×10~(-8) mol/L浓度范围内,鸟嘌呤(G)的氧化峰电流差值与突变基因浓度呈良好的线性关系,检出限为1.0×10~(-11 )mol/L (66 pg/mL) (S/N=3)。 (2)利用二氧化铅(PbO_2)、多壁碳纳米管(MWNTs)与疏水性室温离子液体(RTIL)1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)复合材料修饰玻碳电极(PbO_2-MWNT-RTIL/GCE),制备了一种新型电化学传感器,用于同时或分别检测鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)。当修饰电极在外加电压+0.30 V下于pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中富集120 s后,进行微分脉冲伏安法(DPV)检测,鸟嘌呤和腺嘌呤分别在+0.60 V和+0.89 V处得到良好的氧化峰。与裸电极相比,PbO_2-MWNT-RTIL/GCE不仅明显地提高了鸟嘌呤和腺嘌呤的电化学氧化峰电流,而且降低了它们的氧化峰电位,这表明PbO_2, MWNT和RTIL的协同效应可以很好的提高检测鸟嘌呤和腺嘌呤的灵敏度。实验结果表明PbO_2-MWNT-RTIL/GCE具有良好的稳定性,优异的电催化性能和富集效应,并能同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤(氧化峰电位差为0.29 V)。该修饰电极在最佳条件下,鸟嘌呤和腺嘌呤的检测限分别为1.0 ng/mL和4.0 ng/mL (S/N=3,信噪比)。用这种方法检测鲱鱼精DNA中的鸟嘌呤和腺嘌呤也取得了令人满意的结果。 (3)制备了一种利用免标记法检测禽流感病毒DNA序列的新型DNA电化学生物传感器。首先,将多壁碳纳米管和酞菁钴纳米复合材料(MWNTs-CoPc)以及4.0G树状高分子(PAMAM G4.0)修饰到玻碳电极上,然后以G4 PAMAM为桥梁将DNA探针固定到修饰电极。通过示差脉冲伏安法观察鸟嘌呤氧化信号的变化,来检测杂交反应的进行,避免了外加指示剂的使用。在最佳条件下,互补靶基因浓度在0.01到500 ng/mL范围内,修饰电极上获得的鸟嘌呤氧化信号差值(ΔI_p)与互补靶基因浓度的对数成线性关系,相关系数为0.998,检测限为1.0 pg/mL。


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