性成熟和促性腺激素对小鼠卵母细胞体外发育能力的影响

【摘要】： 利用性成熟前动物体外成熟卵母细胞能够获得大量的卵母细胞进行体外受精、动物胚胎生产和克隆。然而性成熟前动物卵母细胞发育能力远不如性成熟动物,受精后胚胎发育能力差。针对这一问题,许多研究者在细胞和分子水平上比较了性成熟前后卵母细胞的差别,发现卵泡直径、卵母细胞直径、线粒体分布、蛋白和mRNA合成,以及染色质构型等都存在差别。这些差别导致性成熟前动物卵母细胞细胞质成熟不完全,受精率和囊胚发育率下降。所以进一步认识性成熟前后卵母细胞之间的差别,通过改善卵母细胞体外成熟培养环境,提高性成熟前动物卵母细胞发育能力,对于生产实践有重要意义。 针对性成熟前动物得到的卵母细胞发育能力差这个问题,我们以不同周龄的小鼠为研究模型,进行了以下几个方面的研究,希望能找出性成熟前动物卵母细胞发育能力差的原因,从而提高性成熟前动物卵母细胞发育能力。(1)卵泡直径和卵母细胞直径是衡量卵母细胞质量的一个指标,直径大的卵泡卵母细胞发育能力显著高于小直径的卵泡卵母细胞,卵泡和卵母细胞发育同步化程度反映卵泡内颗粒细胞的数量,这些问题在性成熟前后卵泡、卵母细胞上是否有差别；(2)多精受精是性成熟前动物卵母细胞体外受精后普遍存在的问题,多精受精导致胚胎发育异常或发育阻滞,所以我们需要深入研究多精受精产生的原因,降低多精受精比率,提高囊胚发育率；(3)促性腺激素能增加大的有腔卵泡的数量,但是对卵母细胞发育能力的影响,众说纷纭,我们以小鼠为实验模型继续深入研究促性腺激素对性成熟前动物卵母细胞发育能力、多精受精情况的影响；(4)谷胱甘肽是卵母细胞胞质中存在能够促进雄原核形成的物质,近年来被普遍认为是卵母细胞胞质成熟的指标,成熟培养液中添加胱氨酸和半胱氨能够促进卵母细胞胞质中谷胱甘肽的合成,从而改善卵母细胞发育能力,这在性成熟动物中都已经被证明,能否改善性成熟前动物卵母细胞发育能力,以及改善的程度值得研究；(5)对于卵母细胞胞质中谷胱甘肽合成来说,γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶是最为关键的两个酶,其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM),这些酶在性成熟前后小鼠卵母细胞中表达是否存在差别需要进行研究；(6)促性腺激素对卵母细胞胞质中GSH的合成能力以及对GSH合成最为关键的两个酶是否存在影响,需要我们进行研究。 我们得到的结果如下： 1、性成熟前后卵母细胞经过体外受精或者孤雌激活后,幼鼠卵母细胞的囊胚发育率显著低于成年鼠。去除卵丘细胞对卵母细胞发育能力的影响,裸卵卵母细胞发育能力在性成熟前后也有差别,体外受精后,3周到4周小鼠卵母细胞发育能力显著提高,4周小鼠卵母细胞囊胚发育率接近成年鼠水平,孤雌激活后,4周和成年鼠卵母细胞囊胚发育率没有差别。注射PMSG后显著提高了性成熟前后卵母细胞发育能力,裸卵卵母细胞发育能力也得到了显著提高,幼鼠卵母细胞发育能力达到了成年鼠水平。 2、体外受精后,性成熟前后小鼠卵母细胞精子穿透率没有差别,多精受精率幼鼠显著高于成年鼠,而且幼鼠的多精受精没有形成原核的比例显著高于成年鼠。正常受精卵母细胞,雌雄原核直径平均值,性成熟前后卵母细胞没有差别。促性腺激素能提高性成熟前后卵母细胞正常受精的比例,以及雄原核形成比例,同时也提高了性成熟前后卵母细胞正常受精后原核直径。 3、体外成熟后,性成熟前后卵母细胞3周和4周小鼠卵母细胞皮质颗粒迁移不完全比例没有显著差别,4周和6-8周皮质颗粒迁移不完全比例没有显著差别,6-8周皮质颗粒迁移不完全比例显著低于3周小鼠,注射PMSG后,显著提高了皮质颗粒迁移完全的比例,3周和6-8周小鼠卵母细胞没有显著差异,提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都没有差别。 4、体外成熟后,性成熟前后卵母细胞胞质中GSH水平,幼鼠显著低于成年鼠,注射PMSG后,显著提高了性成熟前后卵母细胞GSH水平,幼鼠达到了成年鼠水平。 5、成熟培养液中添加胱氨酸(100μM)和半胱胺(200μM)能提高性成熟前后卵母细胞发育能力,增加浓度(200μM、400μM)没有继续改善卵母细胞发育能力,向PMSG处理组卵母细胞的成熟培养液中添加胱氨酸(200μM)、半胱胺(400μM)显著提高了卵母细胞发育能力,成鼠显著高于幼鼠卵母细胞的囊胚发育率。PMSG处理组添加胱氨酸(200μM)、半胱胺(400μM)也显著提高了卵母细胞发育能力。 6、GSH合成途径中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的两个亚基,催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM)在性成熟前后有显著差别,成年鼠表达量高于幼鼠,谷胱甘肽合成酶表达两者之间没有差别。注射PMSG显著提高了这三种酶mRNA的表达。 7、卵泡和卵母细胞直径以及发育同步化程度不是性成熟前小鼠卵母细胞发育能力差的因素。8、体外成熟卵母细胞SrCl2最佳激活浓度为20mM,这一浓度的孤雌激活率和囊胚发育率最高。