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基于功能材料的新型电化学DNA生物传感器的研制及应用研究

刘香港  
【摘要】:电化学DNA生物传感器由于操作简单、快速、方便、灵敏、价格低廉及易于微型化等优点,已被广泛应用于疾病诊断、药物分析和环境监测等方面。本研究利用功能材料探讨设计了四种新型的电化学DNA生物传感器,并运用其对基因序列和生化小分子进行了实际检测。研究内容主要分以下四部分: (1)利用新颖的电活性、阳离子、水溶性的树枝状聚乙烯亚胺-钴(III)-啉菲罗啉聚合物指示剂和单链中性PNA设计了一种新型的电化学DNA生物传感器,并将其运用于基因序列的杂交检测。本研究中所合成的聚合物指示剂既含有自由的氨基基团又含有显正电性的钴配合物分支,此聚合物不能与电中性的单链PNA探针结合,但当PNA探针与带负电荷的互补ssDNA发生特异性杂交形成双螺旋结构后,它可以通过静电吸附和沟槽嵌入两种方式固定到PNA-DNA上。此传感器可以很好的区分非互补,三碱基和一碱基错配DNA序列与完全互补序列,实现对完全互补DNA序列的特异选择性检测。该传感器被成功的应用于禽流感基因序列的杂交检测,检测范围为:5.0×10~(-9) ~ 2.5×10~(-7) M (R = 0.9940),检测限为:5.6×10~(-10) M。 (2)利用单双链DNA分子柔性的差异设计了一种新型的电化学DNA生物传感器。通过在GNPs表面自组装修饰巯基化的探针DNA和1,6-己二硫醇制备识别界面。DNA杂交和电化学检测分别在GNPs表面和电极表面进行,从而消除了其它生物分子和非互补DNA对测定的干扰。由于ssDNA是柔性分子,dsDNA是刚性分子,当电极表面涂布ssDNA修饰的GNPs时,ssDNA可以发生弯曲而暴露1,6-己二硫醇一端的巯基基团,使其通过形成Au-S共价键而将GNPs固定到电极表面。相反,当电极表面涂布dsDNA修饰的GNPs时,由于刚性的dsDNA不能发生弯曲,其会阻碍GNPs在电极表面的固定。因此,在杂交前后可以获得不同的Rct信号。此传感器可以很好的区分非互补,三碱基和一碱基错配DNA序列与完全互补序列,实现对完全互补DNA序列的特异选择性检测。将该传感器应用于禽流感基因序列的检测,检测范围为:1.0×10~(-9) ~ 2.0×10~(-7) M (R = 0.9937),检测限为:5.0×10~(-10) M。该电化学DNA生物传感器的设计为其它传感器的设计提供了新的思路。 (3)本研究基于DNA适配体和杂化纳米材料修饰电极构建了一种可以灵敏检测基因序列的电化学DNA生物传感器。通过在电极表面修饰MWNT,PPNWs和GNPs提高了测定的灵敏性和选择性。此杂化纳米材料可以在电极表面形成多空结构,具有大的有效表面积,高的电催化活性和导电性。因此,可以明显的增加DNA适配体的固定数量,保持适配体与检测目标的可接近性,进而增大响应信号。此传感器可以很好的区分非互补,三碱基和一碱基错配DNA序列与完全互补序列,实现对完全互补DNA序列的高灵敏性检测。该传感器被成功的应用于禽流感(AIV) H5N1基因序列的检测,检测范围为:5.0×10~(-12) ~ 1.0×10~(-9) M (R = 0.9863),检测限为:4.3×10~(-13) M。此方法不仅实现了对基因序列的灵敏检测并且有希望在其它生物传感器方面得到广泛应用。 (4)本研究通过在电极表面修饰MWNT-Chit/PAMAM固定DNA制备了一种可以在AA存在下同时检测DA和UA的新型电化学DNA生物传感器。运用EIS和CV对修饰电极的电化学特性进行了表征。此传感器对DA和UA具有很强的催化活性并可将在裸电极上原始重叠的UA,DA和AA的氧化峰区分为三个明显的尖峰。该传感器被成功的应用于在大量AA存在下同时检测DA和UA。在1.0 mM AA存在的情况下,对DA检测可以获得两个线性范围:0.2 ~ 10μM (R = 0.9984)和10 ~ 100μM (R = 0.9957),检测限为:0.03μM (s / n = 3);对UA检测的线性范围为:0.5 ~ 100μM (R = 0.9971),检测限为:0.07μM (s / n = 3)。此外,该传感器具有很好的重现性和稳定性。


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