绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【摘要】：本研究的目的是构建绵羊myostatin基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并评估其对myostatin基因表达的沉默效果。方法是,在Genebank中检索目的基因的序列,获得sheep的myostatin的序列,根据ambion的shRNA设计系统,设计、合成4对针对myostatin基因shRNA干扰载体。合成全基因序列,将合成好的全基因序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α,测序验证发现有突变点,通过重叠PCR将基因序列中突变点修复,将突变后的全长片段用XhoI和EcoRI酶切后连接至目的载体pCDNA3.1(+),并转化到感受态细胞DH5α中,经测序验证,重组克隆中插入片段序列与目的基因序列完全一致,高效表达载体构建成功。用Lipofeetamine2000将pcDNA3.1-Ovis aries MSTN质粒、shRNA干扰载体共转染至HEK293细胞,48h后取一部分细胞做qPCR,通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量,采用△△C t的方法进行相对定量,使用转染阴性干扰载体的样品作为对照样品,比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达,并计算干扰效果,shRNA-86C的干扰效果最好,基因沉默效率60.13%,对shRNA-86C进行慢病毒包装。将双链的shRNA oligo插入到shRNA表达载体pENTR?/U6 vector中,构建shRNA表达质粒,使用Invitrogen公司的LR重组系统将pENTR/U6-85-C与慢病毒载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行重组。用Lipofeetamine2000将构建的慢病毒表达载体pL-85-C和包装质粒(Packaging Mix)共转染至生长状态良好,处于对数生长期的293T细胞,48h后收集细胞培养上清,3000rpm离心10 min,去除细胞和碎片,并用0.45um的滤器过滤,将病毒原液在50000g下超速离心2小时,去除上清,重悬于500μl DMEM培养液中,病毒感染细胞HEK293细胞,在倒置显微镜下观察各孔中荧光细胞数,病毒滴度为荧光细胞数除以相应的稀释倍数,测定滴度为8.8×10~9TU/ml,说明有大量质粒转入293T细胞,病毒包装成功。为研究基因沉默前后细胞生物学行为的改变和探讨myostatin基因对双肌性状发生发展中的作用提供实验基础。