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PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达与鉴定

于颖  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种急性传染病,对养猪业的危害极大。我们的前期研究发现感染了PRRSV的猪血清中有两种不同的抗GP5的自身抗独特型抗体(auto-Ab2),在针对PRRSV感染的免疫网络中能起到正向或负向调控作用。我们前期制备的针对抗PRRSV GP5抗体的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)具有结合Marc-145细胞的功能。单链抗体具有免疫原性小,仍保持亲本抗体结合抗原的特异亲和力;而且分子量小,实质组织穿透力强,血浆半衰期短,因此,单链抗体在临床疾病的研究、诊断和治疗方面具有重要的应用价值。为了进一步明确Mab2-5G2结合细胞的功能区域,需要制备只包含抗体可变区片段(Fv)的Mab2-5G2单链抗体(scFv)。本研究从分泌Mab2-5G2的杂交瘤细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以此为模板扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;根据鼠源抗体基因家族可变区的骨架区(framework region, FR)和互补决定区(complementarity-determining region, CDR)氨基酸序列特点,设计并合成了抗体重、轻链可变区基因的引物;以cDNA为模板扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。以VH-linker-VL的形式通过重叠PCR(overlapping-PCR)扩增出scFv基因,基因序列分析表明:VH和VL通过编码(G4S)3连接肽的45bp基因序列连接在一起构成scFv基因,其全长762bp,VH基因位于linker的上游,长360bp,编码120个氨基酸;VL基因位于linker的下游,长357bp,编码119个氨基酸。将scFv与原核表达载体pEasy-E1连接构建原核重组表达质粒pEasy-scFv。将pEasy-scFv转化受体菌E. coli .BL2(1Rosetta)感受态细胞中,经IPTG诱导成功表达了目的蛋白,表达产物主要以包涵体的形式存在。表达后的蛋白经SDS-PAGE分析,其分子量大约为30KD,与预期大小一致。Ni-resin纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上,分别用鼠源抗His的单抗和兔源抗体Ab3为一抗(经纯化的针对Mab2-5G2可变区的抗体)进行Western-blot分析鉴定,结果表明scFv蛋白具有良好的免疫原性。纯化后的ScFv蛋白用尿素梯度为8mol/L~2 mol/L且PH梯度为6~8.5的复性溶液在16℃条件下进行双梯度透析复性,每个梯度透析12h;复性后的scFv蛋白能够具有天然抗体Mab2-5G2的功能可特异性结合Marc-145细胞。分别用Mab2-5G2、scFv免疫新西兰白兔制备抗血清, Mab2-5G2、scFv蛋白能和彼此的抗血清发生交叉反应。


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