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山羊精液液态保存过程中精子葡萄糖代谢的研究

邱建华  
【摘要】:精液保存技术可以使精子不受时间、地域和种畜自身限制,便于开展区域间协作,最大限度提高优良公畜的利用率,加速品种的育成和改良。精液长期保存的方法主要是冷冻保存,但是山羊精液冷冻会引起精子超微结构、生化和功能的损伤,应用冷冻保存的山羊精液输精时,情期受胎率一直比较低(50%左右),限制了该技术在生产中的应用。因此,人们正在探索山羊精液短期保存即液态保存,而这方面研究国内外报道很少,尤其是精子代谢机理的研究。保存过程中精子活力不同程度地下降,限制了保存后精子的应用,同时也限制了体外受精、人工授精等应用技术的推广。保存过程中精子存活时间和受精能力会受到许多因素的影响,例如离子成分、氧化应激、代谢性酸中毒、DNA断裂、精子质膜脂类和蛋白组分发生变化、顶体反应以及自发获能等,发现并消除这些不利因素,减少精液保存过程中精子受到的损伤,构建成分简单明确而又适宜精子体外存活的保存系统,将为精子代谢机理研究提供广阔空间。以成分明确而又简单的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)作为培养液,成功构建山羊精液液态保存系统,并在此基础上对液态保存过程中精子葡萄糖代谢机理进行了研究,以丰富“精子代谢机理”基础理论,为动物生产和医学临床提供理论依据。结果发现: 1)无论是5℃还是15℃保存,无论是卵黄包被与否,稀释液添加钙镁离子均不利于精子存活,缩短精液保存时间。 2)5℃条件下降温保存时,无论是卵黄包被与否,稀释液添加144mM葡萄糖离子均利于精子存活,延长精液保存时间。 3)5℃条件下降温保存时,精液采用卵黄包被处理后再稀释后保存效果好,有利于精子存活。 4)在不用卵黄包被而直接稀释条件下,与5℃、25℃相比,山羊精液以15℃保存效果最好,精子活力保持30%以上的保存时间能达到7d,成功建立起一个成分简单明确而又适宜精子体外存活的保存系统。 5)15℃保存时,稀释液中添加3mM葡萄糖效果最好,精子活力保持30%以上的保存时间能达到9d。而葡萄糖浓度超过5mM/L时,保存效果反而不如不添加好,精子活力保持30%以上的保存时间仅为3d。 6)15℃保存时,在含有葡萄糖的稀释液中添加碘醋酸酯(Iodoacetate)阻断精子糖酵解途径,能显著降低精子活力,缩短精液保存时间。 7)15℃保存时,在含有葡萄糖的稀释液中添加脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone)阻断精子磷酸戊糖途径,对精液保存时间和山羊精子活力没有影响。 8)15℃保存时,在不用卵黄包被条件下,与其它季节相比,冬季精液稀释后精子存活率低,差异显著;而采用卵黄包被而显著提高精子存活率。 总之,通过本研究主要获得以下结论:1)稀释液中添加钙镁离子不利于山羊精子体外存活;2)5℃保存时添加葡萄糖有利于山羊精子活力维持;3)5℃保存时卵黄包被有利于山羊精子活力维持;4)不包被条件下,山羊精子适合在15℃保存;5)15℃保存时,PBS中添加3mM/L的葡萄糖保存效果最好,最有利于山羊精子存活,超过5mM/L不利于精子存活;6)山羊精液液态保存过程中,山羊精子活力维持和对葡萄糖的代谢利用依赖于糖酵解途径;7)山羊精液液态保存过程中,山羊精子活力维持和对葡萄糖的代谢利用不依赖于磷酸戊糖支路。


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