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毒死蜱降解细菌的筛选、降解特性及其固定化研究

段海明  
【摘要】:有机磷农药以其高效、廉价等特点而被广泛应用,但其对人体健康和环境等影响较大是不容忽视的问题。目前国内外已报道的甲基对硫磷降解菌有假单胞菌(Pseudomonas sp.)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)、产碱菌(Alcaligenes sp.)和节杆菌(Arthrobacter sp.)等;毒死蜱降解菌有阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)和玫瑰红红球菌(Rhodocouus rhodochrous)等。但是已报道的细菌由于环境适应性不强等原因,还未达到开发利用的要求,因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。另外,有关同一菌种的不同菌株对有机磷农药的降解差异性也鲜有报道。本研究旨在寻找高效降解有机磷农药的菌株,明确菌株的分类学地位,同时探讨环境条件对菌株降解有机磷农药的影响、单株菌的降解动力学和降解混合菌的构建。进一步提取降解酶,优化产酶条件,明确降解酶的酶促降解特性,进而研究优势菌株的固定化条件和特性。研究结果如下: 1.采用直接分离与富集驯化培养相结合的方法,分离筛选出三株能够降解有机磷农药的菌株HY-1、HY-2和HY-4,在形态特征和生理生化分析的基础上,又对其16S rDNA序列进行了分析,并研究了其对甲基对硫磷(Methyl-parathion)、毒死蜱(Chlorpyrifos)和三唑磷(Triazophos)的降解特性。结果表明:三菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的不同菌株,三菌株在Genbank上的登录号分别为:eu915687、eu915686和eu915688。三菌株在72 h内对初始浓度为50 mg/L甲基对硫磷的降解率分别达到91.7%、88.7%与92.4%,菌株之间无显著性差异(P0.05);在毒死蜱初始浓度为50 mg/L和100 mg/L时,HY-1和HY-4降解毒死蜱的能力和HY-2有显著性差异(P0.05),其中三菌株在72 h内对100 mg/L毒死蜱的降解率分别达到64.8%、53.7%和59.5%;三菌株在72 h内对初始浓度为100 mg/L三唑磷的降解率分布在13.3%–20.7%之间,其中HY-2对三唑磷的降解率较高,并和其余两菌株有显著性差异(P0.05)。可以看出,蜡状芽孢杆菌的不同菌株对有机磷农药的降解存在差异性。 2.以单因素试验探讨了三菌株降解甲基对硫磷和毒死蜱的影响因素,得出了三菌株降解有机磷农药的最适环境条件。结果表明:菌株HY-2能够利用甲基对硫磷和毒死蜱为唯一磷源降解农药。HY-2降解甲基对硫磷的适宜条件为:培养温度30°C–35°C、初始pH为6–8、甲基对硫磷初始浓度为10–50 mg/L、接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到菌悬母液(OD600=3.0)的0.8倍),添加葡萄糖不能促进菌株对甲基对硫磷的降解;HY-2降解毒死蜱的适宜条件为:葡萄糖浓度6 g/L、培养温度30°C–35°C、初始pH为7、毒死蜱初始浓度为80–200 mg/L、接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到菌悬母液(OD600=3.0)的0.8倍)。HY-1和HY-4两菌株降解毒死蜱的适宜条件为:葡萄糖浓度3 g/L、培养温度35°C、初始pH为7–8、毒死蜱初始浓度80 mg/L、接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到所配菌悬母液(OD600=2)的0.5倍)。酵母膏含量对毒死蜱的降解影响表明,当添加3 g/L的葡萄糖时,最适的酵母膏含量为1 g/L,而不添加葡萄糖时,最适的酵母膏含量为5 g/L。在酵母膏试验浓度范围之内,不添加葡萄糖时菌株对毒死蜱的降解率最终也不能达到含有葡萄糖的水平。 3.采用种子液培养基中定量添加毒死蜱和定时取样分析毒死蜱残留浓度的方法,明确了毒死蜱对蜡状芽孢杆菌的生长抑制动力学和菌株对毒死蜱的降解动力学,同时研究了降解菌对高浓度毒死蜱的耐受度和菌胶团的形成能力。结果表明:HY-1、HY-2和HY-4三菌株最适种子液培养时间分别为10、19和15 h。含毒死蜱培养液和空白对照相比,HY-1和HY-2两菌株生长的适应期延长,对数期、稳定期顺序后延。随着培养液中菌体数量的增长,培养液的pH也随之升高。接菌量为8%(V/V)时降解率最高。HY-1和HY-2两菌株对不同浓度的毒死蜱表现出不同的降解规律。对于低浓度的毒死蜱,毒死蜱的浓度随着时间的推移而下降;当毒死蜱浓度较高时,毒死蜱的降解过程包括吸附、解吸和降解等几个阶段。一级动力学方程ln(C0/Ct) = kt可以用来拟合毒死蜱的降解动力学及确定降解动力学参数。研究发现,菌株HY-2比HY-1可以耐受更高的毒死蜱浓度,但HY-1的菌胶团形成能力要高于HY-2。 4.为明确蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合菌株对毒死蜱的降解效果,本研究采用正交试验的方法构建混合菌。以混合菌对毒死蜱的降解率和菌株的生长量为依据,利用单一因素试验考察了不同因素对混合菌降解毒死蜱的影响。两菌株组合时研究发现,HY-1和HY-4两菌株的比例为1:1(V/V)时,对80 mg/L毒死蜱的降解率最高。添加葡萄糖有助于菌株的生长,但是不利于毒死蜱的降解。偏碱性环境对菌株的生长有利,对毒死蜱的降解也有利。菌株的降解动力学研究发现,两菌株混合对毒死蜱的降解和单菌的降解规律相似。两菌株混合时能够耐受20–70 g/L的NaCl浓度,且对80 mg/L毒死蜱的降解率都在41%以上。利用正交试验构建的三菌株组合降解混合菌的体积比为:1:1:3。在含80 mg/L毒死蜱的基础培养基中,接菌量为8%(V/V)时降解率最高,降解最适pH值为7。在试验浓度下,三菌株混合菌对毒死蜱的降解也符合一级动力学方程。混合菌对高盐具有很高的耐受度,当反应液中NaCl浓度在20–100 g/L之间时,三菌株混合菌对80 mg/L毒死蜱的降解率仍较高,最高达61%。 5.以从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1菌株中提取到的降解酶比活力为指标,进行产酶培养基和发酵条件的优化研究。通过单一因素试验和正交试验,对菌株HY-1的产酶培养基和发酵条件进行了优化。运用SPSS 13.0软件进行结果分析,所获优化培养基配方为:葡萄糖6.0 g/L、胰蛋白胨2.2 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 0.1 g/L和微量元素溶液2 mL/L。菌株发酵培养的优化条件为:种子液培养时间16 h、发酵培养时间18 h、接种量1%(V/V)、发酵培养基初始pH值为7.0。在NaCl浓度为0?30 g/L时,所产降解酶比活力不受影响。这是已报道的耐盐性最强的一株毒死蜱降解菌。 6.为明确毒死蜱降解菌-蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1的粗酶液对毒死蜱的降解特性,采用测定粗酶比活力的方法,研究了不同环境因素对粗酶液降解毒死蜱的影响。结果表明:粗酶液中可溶性蛋白的含量为2.21 g/L,测得粗提酶其米氏常数Km为1.2356 mmol/L,最大降解速率Vmax为0.0226μmol/(mg·min)。酶促反应时间为1 h时,粗酶液对50 mg/L毒死蜱的降解率最高可达74%,粗酶液加入量为1 mL时的比活力最高。在20°C ?44°C的温度范围内,粗酶液都能保持较好的降解活性,其中最适温度为28°C;在pH 5?9之间时,粗酶比活力都能达最高比活力的66%以上,最适pH为6。进一步研究发现,该粗提酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,在温度为-20°C ?40°C,pH为4?8的条件下,暴露1 h仍能保持较高的比活力。该粗酶液在10?70 g/L的NaCl浓度下保持1 h仍能高效降解毒死蜱。该降解粗酶与国内外已报道的毒死蜱降解粗酶相比,其耐盐性是最高的,故进一步开发应用价值较大。 7.以海藻酸钠为载体,采用注射器滴定方法将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1用海藻酸钠溶胶包埋,研究固定化菌对毒死蜱的降解效果。结果表明:海藻酸钠固定化菌能高效降解基础培养基中100 mg/L的毒死蜱。当培养时间为60 h时,固定化菌对100 mg/L毒死蜱的降解率最大。固定化菌颗粒接入量为160 g/L时,其对100 mg/L毒死蜱的降解率最高。固定化菌对毒死蜱的降解有着较宽泛的pH适应范围,在pH 5–10时都能高效降解毒死蜱。当毒死蜱初始浓度为80 mg/L和100 mg/L时,固定化菌对毒死蜱的降解率较高,达90%左右。固定化菌重复利用4次后,其对100 mg/L毒死蜱的降解率仍达47%。因此,固定化菌在毒死蜱污染的净化去毒方面有着重大的现实意义。


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