胁迫诱导棉花microRNA的差异表达分析

【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一类内源性的、非编码单链小RNA。近年来研究发现,miRNA作为基因表达中的一类负调控子,不仅在植物新陈代谢、器官发育及组织分化中起重要的作用,而且可以响应植物的生物和非生物逆境胁迫,在植物感受逆境胁迫而做出适应性调整的过程中发挥着重要的作用。因此,对胁迫诱导miRNA进行研究,有助于探明植物逆境适应反应的“成因机理”以及miRNA所介导的基因表达调控网络,为提高转基因植物抵抗胁迫的能力提供新的途径。 本研究选用高盐和黄萎病两种代表性的环境胁迫(前者是非生物胁迫,后者是生物胁迫)对棉花进行胁迫处理,利用生物信息学预测和实验验证相结合的方法,鉴定了棉花中的miRNA,分析了胁迫诱导条件下棉花miRNA的差异表达情况,初步探讨了差异表达miRNA在抗逆反应中所起的作用,为阐明棉花耐盐和抗黄萎病的调控途径提供参考。本研究获得的主要结果如下: 1.在miRBase数据库(Release 10.1)中筛选出保守的植物miRNA家族,并以它们的序列作为“种子序列”应用于同源搜索miRNA方法当中,在EST、GSS和Core-Nucleotide数据库中搜索预测miRNA,从而改进miRNA计算机预测方法。 2.利用改进的miRNA计算机预测方法预测了棉花等作物中的miRNA。在预测的得到的棉花miRNA中,有2个来自于GSS序列,3个来自于Core-Nucleotide序列,其余的16个来自于EST序列。 3.利用miRNA芯片验证以上预测得到的棉花miRNA,芯片杂交结果显示其中10个属于可检测miRNA。利用荧光定量PCR检测了miRNA在高盐胁迫条件下,两种棉花品系(耐盐品系山农91-11和盐敏感品系鲁棉6号)中的表达情况。结果显示:高盐胁迫条件下,miR156a、miR156d、miR156e和miR169在耐盐品系山农91-11中表达量下调,miR167a和miR399a表达量上调,而miR159在盐敏感品系鲁棉6号中表达量下调。 4.利用生物信息学预测得到棉花miRNA的靶基因共23个,利用荧光定量PCR检测了5个靶基因的表达情况。结果显示:高盐胁迫条件下,SPL3,RNA helicase和HAP2在耐盐品系山农91-11中表达量上调,而ARF8和Ghi.6739表达量下调。 5.以陆地棉-冀棉11(易感黄萎病)和海岛棉-海7124(抗黄萎病)为研究材料,分别建立了正常生长和黄萎病菌侵染条件下的四个小RNA库,然后利用高通量Solexa测序共获得68 970 173条小RNA序列;结合生物信息学分析得到215个棉花miRNA;不同样本间小RNA种类及数量差异显著,平均约有40%的Unique sRNA为样本特有sRNA。 6.将四个小RNA库中miRNA数量归一化,比较miRNA表达量的差异。结果显示:在冀棉11中,38个miRNA在黄萎病菌侵染条件下表达量下调,15个miRNA表达量上调;在海7124中,24个miRNA在黄萎病菌侵染条件下表达量下调,15个miRNA表达量上调。此外,在正常生长和黄萎病菌侵染条件下,分别有54个和44个miRNA在两种棉花材料之间表达量有显著差异。生物信息学预测得到了63个miRNA的靶基因共161个,其中与胁迫、信号转导和防御密切相关的靶mRNA序列共25个。