苹果bHLH转录因子MdTTL1对低温诱导花青苷合成和果实着色的多途径调控

【摘要】：果实的颜色是果树重要的农艺性状,决定了苹果等果树的食用和市场价值。苹果果皮的颜色是由花青苷决定的。花青苷的合成受光照、温度和营养等环境因素的影响。在过去一个世纪中,全球气温不断升高。这种气候的变化已经影响到了苹果的着色。所以,阐明低温诱导或高温抑制苹果果实着色的分子机理对于苹果的生产至关重要。 本文以新红星苹果(Malus Domestica Borkh cv. Starkrimson)果实为试材,利用差异筛选的方法,克隆到一个低温响应的bHLH转录因子,命名为MdTTL1(GeneBank登录号为JF920725)。cDNA全长2687bp,编码710个氨基酸,保守域分析表明,MdTTL1蛋白含有bHLH(basic Helix-Loop-Helix)功能域。将该蛋白与拟南芥所有的bHLH蛋白进行进化树分析,发现MdTTL1与Ⅲf亚组调控类黄酮和表皮细胞命运的蛋白聚为一类,并与AtTT8同源性最高,所以命名为MdTTL1(TT8 like1)。进一步分析表明,MdTTL1与苹果MdbHLH3、葡萄VvMYC1、矮牵牛PhAN1等多种植物中调控花青苷代谢的bHLH蛋白同源性最高。 RT-PCR分析发现,MdTTL1在苹果果实、幼叶、茎中都有表达,但在着色的果皮中表达量最高;并且受低温的诱导。根据抗原决定簇预测分析和生物学软件序列比对结果,选取一段编码蛋白,合成多肽作为抗原制备抗体。Western blot检测结果表明,MdTTL1在UV17℃处理下蛋白表达升高和UV27℃下蛋白呈降解趋势。 酵母双杂和双分子荧光互补分析表明MdTTL1能够与MdMYB1互作,剪切试验发现N-端1-228个氨基酸是与MdMYB1互作的必需区域。另外,EMSA和ChIP离体和活体两种方法证明MdTTL1与MdUFGT和MdDFR的启动子结合,进一步的启动子瞬时表达和GUS稳定表达分析表明,MdTTL1蛋白正调控MdUFGT启动子,并且在低温下促进作用更强。 为了进一步确定MdTTL1在苹果内的功能,我们构建了pBI121-MdTTL1和pBIN-MdTTL1-GFP过量表达载体,利用农杆菌侵染法转化嘎拉组培苗和王林愈伤组织。用低温和UVB处理转基因愈伤,分析了转基因愈伤的花青苷变化趋势和MdTTL1的蛋白表达水平,表明MdTTL1转基因愈伤在UVB存在的条件下可以积累花青苷,并且在低温下花青苷含量表达上升。蛋白表达水平变化不大,由此可以推断MdTTL1存在翻译后修饰。Western blot结果证明MdTTL1在低温下发生了蛋白磷酸化,并且这种低温诱导的磷酸化可以被星孢菌素(10μm stau)所抑制。转基因嘎拉明显增加了根内的花青苷含量,并且在低温下花青苷含量更高。另外,转基因组培苗还有矮化的表型,ChIP实验表明,MdTTL1结合到MdCBF2和MdCBF3的启动子上。为了证明MdTTL1在苹果果实着色过程中的功能,利用瞬时表达载体IL-60-BS将其在新红星果皮中过量表达能够促进注射孔周围的着色进程,抑制其表达抑制了注射孔周围的着色,由此说明MdTTL1在苹果果实着色过程中起着正调控的作用。