番茄景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶基因的克隆及遗传转化

【摘要】：番茄(Lycopersicon esculentum)是我国主要的设施蔬菜,属于冷敏感和喜光植物。景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶(SBPase)位于Calvin循环的再生和同化阶段的分支点上,对维持Calvin循环中RuBP的再生以及碳源的流通具有十分重要的作用。尽管SBPase在植物体内含量很低,却是限制RuBP再生速率的关键酶。通过基因工程的手段提高光合酶的含量和活性,对改良作物的光合能力具有重要意义。 本研究以番茄为试材,克隆SBPase基因,分析其在番茄中的内源表达特性和昼夜变化模式;构建正、反义表达载体,通过农杆菌介导转化番茄,获得了转基因植株,分析了SBPase对番茄生长发育及光合作用的影响及其影响机理。研究结果如下: 1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到SBPase基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为LeSBP(FJ959073)。该基因全长为1564 bp,ORF为1185 bp,编码394个氨基酸,分子量约为42.5 kDa。 2.同源序列比较发现,番茄的SBPase氨基酸序列与黄瓜、桑树、拟南芥、菠菜、小麦、水稻和衣藻的同源性分别为83.80 %、85.03 %、80.05 %、80.71 %、76.65 %、78.45 %和61.31 %。在SBPase氨基酸序列中,有6个Cys(cysteine)是保守的,其中的2个Cys形成的CGGT(A/Q)C结构,是参与光调节反应的氧化还原活性位点。 3.构建了原核表达载体pET-LeSBP,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达。以诱导蛋白免疫小白鼠,制备抗血清。测得效价为1:500,可以用于番茄中SBPase蛋白的免疫分析。 4. Real-time PCR和Western杂交结果显示,SBPase在番茄叶、茎和绿色果实中均有表达,以叶片中表达量最高,明显高于其他组织,在不含叶绿体的根中没有检测到该基因的存在;在不同叶位叶片中以中部功能叶(第8片展开叶)表达量最高,上位叶和下位叶表达量较低;第8片展开叶的Pn明显高于第1, 4, 12和16片展开叶,不同叶位叶片的Pn与SBPase基因表达量及活性的变化趋势一致;番茄功能叶片(第8片展开叶)的Pn和SBPase活性及其mRNA相对表达量呈现相同的日变化趋势,说明SBPase对番茄的光合作用具有重要的调控作用。 5.将获得的LeSBP与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用Real-time PCR和Western杂交方法对具有卡那抗性的转基因番茄植株检测,结果显示,转正义基因植株中LeSBP在转录水平和蛋白水平过量表达,反义植株中基因发生沉默。 6. LeSBP过量表达时,转正义番茄植株的SBPase活性与Pn明显提高,碳水化合物积累量增多,茎加粗,叶面积变大,干物重量及根/冠比增加,初花期比野生型提早5~7 d;反义抑制LeSBP表达时,SBPase活性下降,Pn降低,茎变细,叶面积变小,生长缓慢,初花期延迟2~5 d。 7.低温胁迫2 h,番茄叶片的LeSBP表达量及SBPase活性显著降低,Pn明显减小,Fv/Fm和фPSII变化不大。转正义番茄植株的Pn下降幅度和电解质渗漏率增加幅度明显小于野生型,Fv/Fm和фPSII与野生型差异不显著;而反义介导的LeSBP的缺失导致转反义番茄植株的Pn下降幅度和电解质渗漏率增加幅度明显大于野生型。可见LeSBP过量表达可减轻低温对番茄光合作用的影响,提高番茄的耐冷性。