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四种植物源化合物对甜菜夜蛾酚氧化酶的影响及酶免疫学研究

王树栋  
【摘要】:酚氧化酶(Phenoloxidase, EC.1.14.18.1, PO),在昆虫的正常发育过程中具有重要生理作用:(1)参与表皮的硬化和黑化;(2)对卵壳的鞣化作用;(3)参与伤害防御;(4)加速伤口的愈合,等等。研究植物源化合物对昆虫幼虫酚氧化酶的影响和酶免疫学作用对开发以酚氧化酶为靶标的新型害虫控制剂具有重要的理论意义。由于酚氧化酶具有重要的理论意义和发展前景,大量的研究工作集中在此领域,寻找昆虫酚氧化酶高效抑制剂成为研究热点。 在前期研究基础上,本文研究了甜菜夜蛾(Spodoptera exigua(Hübner))幼虫酚氧化酶的部分酶学特性,测定了木犀草素(Luteolin)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin,PPT)、熊果酸(Ursolic acid,UA)和齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)四种植物源化合物对甜菜夜蛾幼虫酚氧化酶的抑制活性及抑制动力学,采用摄食毒力法研究了这四种化合物对甜菜夜蛾幼虫生长发育的影响,并初步探讨了酚氧化酶在甜菜夜蛾幼虫生长发育过程中的免疫学功能。本论文主要研究内容和结果如下。 1.对甜菜夜蛾幼虫酚氧化酶初步纯化后研究其部分酶学特性。(1)酚氧化酶催化底物最适温度为40℃,温度在25-40℃范围内酶稳定性较好;最适pH值为6.5,pH在6.0-7.5范围内酶稳定性较好。(2)部分金属离子会影响酚氧化酶活性,Mn2+、Zn2+、Fe2+和Mg2+有激活作用,Cu2+和Cu+在低浓度范围内也有激活作用但在较高浓度范围内却均表现出抑制作用;金属螯合剂EDTA和DETC能明显抑制酚氧化酶活性。(3)部分有机溶剂能影响酚氧化酶活性,甲醇、乙醇、丙酮和二甲苯四种有机溶剂有一定的抑制作用且以二甲苯的抑制程度最高。苯和二甲基亚砜(DMSO)在较低浓度范围内对酶也有抑制作用但在较高浓度范围内表现出一定的激活作用,随后又表现出抑制效果。2.研究了四种植物源化合物木犀草素、鬼臼毒素、熊果酸和齐墩果酸对甜菜夜蛾酚 幼虫酚氧化酶的抑制活性及抑制动力学,并初步探讨了其抑制机理。研究结果表明:四种化合物对酶均有一定的抑制作用,抑制中浓度(IC50)分别为0.4685 mmol·L~(-1)、0.2500 mmol·L~(-1)、0.3385 mmol·L~(-1)和0.1701 mmol·L~(-1)。四种化合物均为可逆竞争型抑制剂,抑制常数(Ki)分别为13.11 mmol·L~(-1)、0.0895 mmol·L~(-1)、0.2013 mmol·L~(-1)和0.09709 mmol·L~(-1)。理论分析后推测,木犀草素的抑制作用与该化合物和底物在羟基部位有一定的结构相似性有关,鬼臼毒素的抑制作用可能是通过对氧化性物质的清除来实现的,熊果酸的抑制作用可能与该化合物含有羧基有关,而齐墩果酸的抑制作用可能与该化合物含有羧基有关,也可能与改变蛋白质分子构象有关。 3.以摄食毒力法测定四种植物源化合物对甜菜夜蛾幼虫生长发育的影响。结果表明,四种化合物对3龄前幼虫均表现出一定的毒杀活性,处理后11 d,四种化合物的致死毒力LC50分别为2.53 g·L~(-1)、1.84 g·L~(-1)、6.80 g·L~(-1)和6.04 g·L~(-1);四种化合物对3龄后幼虫的生长发育也都具有一定的抑制作用,且对幼虫体重增长的抑制效果随着化合物浓度的提高而提高。四种化合物中以鬼臼毒素的抑制作用最好,用2.50 g·L~(-1)浓度处理48 h后,体重增长抑制率可达到60.01%;以熊果酸的抑制作用最差,用很高浓度(16.0 g·L~(-1))处理48 h后,体重增长抑制率才能达到62.58%。四种化合物均能明显影响到试虫幼虫的化蛹及蛹羽化,在既定化合物浓度范围内,化蛹率和羽化率均低于对照,且化蛹率和羽化率随着化合物浓度提高而降低。四种化合物中以木犀草素对幼虫化蛹及蛹羽化的影响最强,用1.60 g·L~(-1)浓度的化合物处理幼虫后,平均蛹重为0.0647 g·头-1,化蛹率和羽化率分别为36.67%和36.67%;以熊果酸的影响最差,用16.0 g·L~(-1)浓度的化合物处理幼虫后,平均蛹重为0.0755 g·头-1,化蛹率和羽化率分别为53.33%和46.67%。 4.以大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株为免疫刺激因子,研究了甜菜夜蛾幼虫在受到细菌侵染后所产生的免疫反应及酚氧化酶活性变化。结果表明,大肠杆菌E. col水悬浮液与甜菜夜蛾幼虫血淋巴一起冰浴后,其血淋巴酚氧化酶活性明显上升,比对照提高112%;将血淋巴进行离心除去血细胞后与E. coli一起冰浴,则不能使酚氧化酶活性升高;离心后的血浆与胰蛋白酶一起冰浴,随着胰蛋白酶浓度的升高,酚氧化酶活性也逐渐升高,说明血浆中有酚氧化酶酶原(prophenol oxidase,proPO)存在;研究认为试虫体内对入侵病原菌E. coli起识别作用的识别因子存在于血细胞或其它大分子的表面。将病原菌E.coli采用注射法注入试虫体内2 h后,试虫体内很快出现黑色的结节(Nodules),表明很快就发生了免疫防御反应,13 h左右形成的结节数量达到最高状态;在结节形成的同时,试虫血淋巴酚氧化酶的活性也明显发生变化,在E. coli注入后的4 h内,酚氧化酶活性大幅下降,此后下降速度变缓,至10 h左右活性降至最低点,然后随着时间的延长,酚氧化酶活性逐渐恢复,25 h左右恢复到正常水平,说明酚氧化酶参与了结节的形成。


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