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中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27.6的克隆、鉴定与功能分析

刘昭华  
【摘要】:小分子热激蛋白(sHSPs)基因的功能是分子生物学领域的研究热点之一。sHSPs在生物体应对一系列内部应激和外部应激的细胞防御中起重要作用,而在昆虫的免疫系统中的作用也逐渐被发现。中华蜜蜂是我国的特色蜂种,它耐寒抗病,善于搜集零星蜜源,对于维护与其有关的植物共生生态系统的平衡具有重要的经济价值和社会效益。本研究以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为材料,首次克隆得到小分子热激蛋白基因Hsp27.6;利用半定量PCR的方法分析了AccHsp27.6在不同部位,不同发育阶段以及在各种外界应激条件下的转录水平表达模式;并获得了有活性的体外融合蛋白。为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定了基础。本研究的主要结果如下: 1.通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从中华蜜蜂中克隆得到Hsp27.6基因,命名为AccHsp27.6,其GenBank登陆号为GQ254650,cDNA全长1,014bp,包含76bp的5′UTR,223bp的3′UTR和708bp的ORF,编码一条含有236个氨基酸残基,分子量约为27.6kDa的多肽链,等电点约为7.53。序列分析发现,AccHsp27.6具有热激蛋白家族的保守结构域α晶状体结构域,氨基酸序列比对显示AccHsp27.6与McsHSP (GenBank登陆号EU624206) and NvHsp21.7(GenBank登陆号XP001604512)的同源性分别达到43.88%和44.07%。基因组DNA克隆显示,AccHsp27.6没有内含子,并且在5′端空白区域发现了若干个假定的转录因子结合位点,比如有7个热激元件(Heat Shock Element,HSE)和3个NF-κB结合位点,它们的存在提示AccHsp27.6可能会具有某种免疫功能。 2.半定量PCR分析显示,AccHsp27.6在所有测试的部位和发育阶段都有表达。将中华蜜蜂的成年蜂或幼虫暴露于各种应激条件中并检测AccHsp27.6转录水平的表达模式。这些应激条件包括高温,H2O2,6种化学试剂(CO_2,SO_2,甲醛,乙醇,丙酮,氯仿),4种农药(辛硫磷,啶虫脒,蚊蝇醚,菊酯)以及4种微生物侵染(Staphylococcusaureus,Micrococcus luteus,Bacillus subtilis,Pseudomonas aeruginosa)。其中除CO_2,蚊蝇醚,菊酯,枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌可以抑制AccHsp27.6的转录表达水平外,其余应激条件均可诱导AccHsp27.6的转录表达。 3.分别以pMD18-T simple和pET-30a(+)为克隆载体和表达载体构建了AccHsp27.6基因编码区的原核融合表达载体AccHsp27.6-pET-30a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)并对其表达条件进行优化,在IPTG诱导下表达出大小约为36kDa的融合蛋白并进行纯化。将纯化蛋白进行体外活性检测,抑制MDH热聚沉实验显示重组AccHsp27.6蛋白具有显著的体外分子伴侣活性,纸盘稀释法抑菌实验显示重组AccHsp27.6蛋白具有显著的体外抑菌活性。 本研究结果表明,AccHsp27.6在应对生物性和非生物性刺激的反应中起到重要作用,在中华蜜蜂免疫防御机制中具有潜在的功能。


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