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茶多酚氧化酶基因的克隆及其工程菌的构建

王乃栋  
【摘要】:茶黄素作为一种茶叶所特有的色素物质,由于其具有极强的抗氧化及清除自由基的功能,近些年来受到研究者的广泛关注,并在保健和抗癌治癌等领域成为研究热点,是目前茶叶深度开发领域研究的热点成分,在天然药物、功能食品、日用化工、功能饮料等领域有着广泛的应用前景。茶黄素的合成机理是儿茶素在茶多酚氧化酶(PPO)的催化作用下氧化聚合形成邻醌,邻醌进一步缩合形成茶黄素。目前茶黄素的生产技术主要为体外酶促氧化的方法,其中多酚氧化酶是催化反应合成茶黄素的关键酶,如何得到大量、优质的酶源成为提高茶黄素生产技术的关键因素。 本文旨在通过基因工程的手段,利用融合蛋白表达系统,构建出茶PPO的基因表达载体,并进一步将其转入优势表达菌中,以期构建出茶PPO基因工程菌,并对其进行应用基础研究,从而解决茶黄素生产的关键酶源问题,进而为茶黄素的工业化生产提供一定的理论依据和研究基础。主要研究结果如下: 通过对各种CTAB法的综合与优化成功提取并纯化得到了纯度较高的迎霜茶树基因组DNA,并通过PCR扩增得到PPO的编码区片段。通过测序可知,迎霜茶树的PPO编码区序列长度为1800bp。并将其登录于GenBank,注册号为GQ214317。 对PPO的核酸序列以及翻译得到的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:所得到的迎霜品种茶树PPO基因与其他茶树基因都高度同源,相似性达到99%以上;PPO基因共编码599个氨基酸,分子式为C3008H4677N813O900S18,分子量为67207.2,理论等电点为6.24。PPO同属于酪氨酸酶、PPO1_DML和PPO1_KFDV三个超家族,且PPO的关键结构域Cu2+结合区具有高度的保守性;且PPO没有跨膜区,不存在信号肽,其存在于叶绿体的可能性最大,很有可能具有叶绿体转运肽。 将克隆得到的PPO基因重组到pET-28a表达载体上,构建出原核表达载体pET-PPO,并将其转入E. coli BL21(DE3),实现了PPO的原核诱导表达。原核表达过程中,目的蛋白容易形成包涵体,酶的活性较低;SDS-PAGE电泳检测结果表明,在71KD处有一条特异蛋白条带,与预测大小相符。 将克隆得到的PPO基因重组到pPICZα A融合蛋白表达载体上,构建出茶PPO的融合蛋白真核表达载体pPICZα-PPO2,并将其转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。 对PPO的真核蛋白表达进行优化策略研究,首先对PPO基因进行改造,构建出茶PPO的融合蛋白真核表达载体pPICZα-PPO3和pPICZα-PPO4。然后将pPICZα-PPO2、pPICZα-PPO3和pPICZα-PPO4分别转入巴斯德毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168三种酵母菌种中,得到9种PPO的重组转化子,同时筛选出相应的阳性转化子,并对其进行甲醇诱导表达,Western-Blotting结果表明:9种组合中,只有转化了pPICZα-PPO2的GS115重组酵母得到了PPO阳性表达。 最后,对PPO基因工程菌进行应用基础研究显示:诱导表达的PPO的粗酶液酶活力为63.6U;遗传稳定性较好,在诱导3天后开始表达目的蛋白,并在7天后仍然保持目的蛋白的表达。


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