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低温胁迫下番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因的表达和功能研究

段明  
【摘要】:低温是一个重要的环境因子,严重地影响作物的生长发育,导致产量和品质降低。低温胁迫下,植物体内代谢反应的不平衡导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量产生,若未及时清除,ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤,进而导致细胞及组织死亡。植物在长期的进化适应中,形成了一套解毒机制,以避免ROS过量积累对细胞产生伤害。这包括一些低分子量的抗氧化物质参与的非酶促方式、一些酶类以及参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-Glu cycle)的酶,包括抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidsae, APX)、谷胱甘肽还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶等。在APX-Glu循环中,APX是其中的关键酶,它对于保护叶绿体和其它细胞组分免受H2O2及其所产生的羟基自由基的破坏是必不可少的。因此,研究APX基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。 本研究从番茄品种中蔬6号叶片中分离到类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因(LetAPX),对其序列特征、表达模式,以及转基因番茄的抗逆生理功能进行了探讨。主要结果如下: (1)从番茄中分离到类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因LetAPX,该基因开放阅读框编码一个421个氨基酸的蛋白。同源序列比较发现,番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因的序列与烟草、南瓜、冰叶日中花的tAPX基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明LetAPX有两个序列保守的结构域,domain I是APX酶的激活位点,domain II是APX酶与血红素的结合位点。 (2)将p35S-LetAPX-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中瞬时表达。通过Confocal观察到GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明LetAPX基因产物定位于叶绿体。 (3)Northern杂交分析表明,LetAPX基因的表达受低温、强光、甲基紫精、水杨酸等胁迫和信号分子诱导,其表达水平随胁迫处理时间的延长而变化。 (4)将获得的LetAPX基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型相比,过表达LetAPX基因的番茄叶片APX活性增加,H2O2含量较低。LetAPX基因表达发生沉默的番茄植株APX活性降低,H2O2含量较高。 (5)构建了原核表达载体pET-LetAPX,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫BALB/c小鼠,制备抗体,其抗血清效价为1:500。Western杂交表明,转正义基因植株中LetAPX已在蛋白水平过表达。另外分别对低温、盐、干旱、H2O2处理的野生型番茄进行了Western杂交分析。结果表明,LetAPX在蛋白水平的表达随胁迫处理时间的延长而变化。 (6)正常生长条件下,野生型与转正义基因植株生长量无明显差别。但是,低温度胁迫条件下,转正义基因番茄幼苗生长量明显高于野生型,过表达LetAPX基因提高了番茄植株的抗低温能力。 (7)在低温弱光(4℃,100μmol m-2s-1)胁迫条件下,野生型和转基因株系的净光合速率(Pn)和PSII最大光化学效率(Fv/Fm)下降,但与野生型相比,转正义基因株系T-12、T-22和T-23的下降缓慢,而转反义基因株系T-3、T-5和T-9的下降更为明显。这表明LetAPX的过表达减轻了PSII的光抑制程度,与野生型相比,转正义基因植株PSII反应中心受伤害较轻,而转反义基因番茄的PSII反应中心受伤害较重。在低温弱光处理过程中转基因植株与野生型的氧化态P700降低,恢复过程中,与野生型相比,转正义基因植株恢复较快。低温处理后,转基因和野生型丙二醛含量均增加,转反义基因植株显著高于野生型。 (8)低温条件下,野生型和转基因株系的AsA含量显著增加,野生型与转正义基因植株的AsA含量无明显差别,但转反义基因植株的AsA含量显著高于野生型。这表明AsA作为一种重要的抗氧化物质,其含量的增高弥补了APX的缺失。 (9)应用荧光定量PCR的方法对野生型和转反义基因株系抗氧化及胁迫相关基因的表达进行定量分析。结果表明,低温处理6h,反义株系中抗氧化基因的表达量与野生型相比明显较低,但低温处理12h后,其表达量高于野生型。 (10)透射电镜照片显示,低温处理12h,与野生型植株相比,转正义基因植株伤害较轻,反义植株膜系统降解较重,淀粉粒明显增多,叶绿体变圆。LetAPX基因有利于保护叶绿体等细胞超微结构免受低温的破坏。


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