高温胁迫诱导的可变剪切调控植物MicroRNA加工的研究

【摘要】：各种生物胁迫（如病原菌的侵染）和非生物胁迫（如干旱、高温等）严重影响和威胁了植物的整个生长发育过程。在各种自然灾害中，干旱与高温是世界范围内最严重、最普遍的两种环境胁迫。干旱、半干旱地区遍及50多个国家和地区，总面积占到陆地面积的1/3，而我国将近一半的国土面积属于干旱、半干旱地区。近年来，全球遭受干旱胁迫和高温胁迫的范围逐步扩大，对植物的影响亦愈加严重。植物在长期进化过程中建立了一系列适应各种生物和非生物胁迫的机制，现在已有实验证据表明大量胁迫响应基因参与了植物抗逆过程，并且在这一过程中发挥关键作用。转录水平调控是基因表达调控的主要形式；基因首先通过pre-mRNA剪接，内含子移除，外显子拼接等一系列过程加工成mRNA；然后经过翻译加工修饰后形成完整的功能蛋白。可变剪接可以通过选择同一mRNA的不同位点，采用多种剪接方式进行加工，产生多种剪切变体，进而增加整个基因组转录和翻译水平的多样性。目前，许多报道发现环境胁迫直接影响了植物抗逆过程重要基因的正常剪切和基因表达，在转录水平进行调控。 MicroRNA（miRNA）是真核生物中普遍存在的一类内源具有调控功能的非编码小RNA，通过碱基互补匹配结合下游靶基因mRNA，在转录后水平和翻译水平介导靶基因的沉默。近些年来，研究人员发现miRNA参与了生物体生命活动的多个步骤：包括染色体的形成、RNA的剪切和修饰、转录、mRNA的稳定、蛋白质的翻译转运等。miRNA同时响应外界环境变化，直接参与并调控多种植物胁迫响应关键基因，在植物抵抗逆境胁迫方面扮演着重要角色。因此，研究逆境胁迫响应miRNA以及miRNA在植物抵抗逆境胁迫时的功能成为分子生物学的研究热点。但是对于miRNA如何响应逆境信号，完成自身胁迫应答调控机制的研究却少有报道。到目前为止，可变剪切作为一种广泛存在的转录后调控的重要机制，还没有直接证据表明其参与调控miRNA的表达。本研究以拟南芥为研究材料，发现并证明了逆境胁迫所触发的可变剪切调控了植物中miRNA的表达，主要的实验结果如下： 1．胁迫响应miRNA的筛选和鉴定 实验室利用生物芯片的方法筛选并鉴定了拟南芥中响应环境胁迫（低温、干旱、高盐）的miRNA。芯片结果显示14个miRNA受到胁迫处理时表达量发生明显变化，其中有10个、4个和10个miRNA分别响应高盐、干旱和低温胁迫。miR400作为一个来自于内含子，并且单一响应温度胁迫的miRNA，被选做进一步研究的对象。 通过序列分析及反转录实验证明，miR400位于宿主基因5′末端的非编码区内，与宿主基因共同转录。GUS染色和活性测定结果与实时荧光定量PCR结果一致，表明各个组织器官中miR400与宿主基因共表达，说明二者位于一个转录单元内，共用同一个启动子。 2．温度胁迫对miR400表达的影响 实时荧光定量PCR和Northern杂交的结果显示，4℃低温处理诱导miR400前体与宿主基因表达，二者表达量随着低温处理时间延长逐渐增加。miR400的成熟体呈现同样表达趋势，说明在低温胁迫下miR400的积累可能由于转录水平增加导致。启动子染色与活性分析与推测结果一致，显示在低温胁迫条件下，整个基因转录水平的提高导致miR400与宿主基因表达量的增加。 实时荧光定量PCR和Northern杂交分析结果显示miR400和宿主基因对高温胁迫处理表现出了不同响应趋势，miR400前体表达量在高温胁迫的条件下明显升高，同时miR400成熟体的表达量却明显减少；宿主基因在高温胁迫条件下表达量没有显著变化，说明高温胁迫对miR400和宿主基因的调控非常复杂，可能不是由单独的转录调节直接导致，推测miR400对高温胁迫响应的过程中还存在新的调控机制。 3．高温胁迫触发可变剪切现象的分析 半定量PCR检测结果表明，miR400前体所在的整个内含子存在一种高温胁迫特异触发的可变剪切现象。结果分析显示这种可变剪切随着高温处理的温度上升及持续时间增加而逐渐增加。剪切片段测序结果表明，内含子3′末端出现100bp碱基丢失，导致包含miR400前体在内的部分内含子区域保留在宿主基因5′端非编码区上，这种可变剪切现象的发生直接导致了miR400前体的积累。 通过构建了不同表达载体来模拟可变剪切中出现的不同剪切产物，利用拟南芥稳定表达和本生烟草瞬时表达验证实验假设。实验结果表明，miR400前体能否从5′端非编码区上的内含子正常剪切，是miR400成熟体正常加工的关键。因此，我们认为在高温逆境胁迫影响下可变剪切是造成miR400表达量下降的主要原因。可变剪切不但造成miR400前体的积累，同时也是抑制miR400成熟体的表达。 4．可变剪切信号分析及鉴定 针对可变剪切抑制miR400表达， miR400所在内含子的序列分析表明，包括前体在内的miR400二级结构没有受到影响，仍然可以正常折叠形成成熟miR400。点突变实验结果表明，剪切信号的变化直接导致特殊条件下可变剪切的发生，通过检测整个内含子剪切信号发现，在可变剪切过程中片段的丢失影响剪切信号的精确识别。miR400所在内含子剪切信号的变化，影响原有内含子正常剪切，诱导可变剪切发生，进一步抑制miR400前体剪切及成熟体加工。 5．miR400功能鉴定及可变剪切调控普遍性分析 在高温胁迫处理条件下，miR400过表达转基因植株的萌发率，下胚轴，根长以及成活率明显低于野生型植株，这说明miR400在植物参与逆境胁迫过程中起着十分重要的作用。 利用生物信息学工具，在拟南芥中发现并鉴定了17个位于基因内部的miRNA，分析结果表明8个miRNA可能直接受到可变剪切调控。在拟南芥亲缘关系最近的物种芸薹属代表植物中发现，miR400表达量在高温胁迫条件下明显减少，仍然受可变剪切调控。以上实验结果说明，可变剪切这一调控机制普遍存在于多种植物中。