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益生乳酸菌的筛选及其在食品加工上的应用研究

赵龙玉  
【摘要】:乳酸菌及其发酵产品对机体具有诸多益生作用,如调节肠道菌群、提高免疫力、提高抗氧化功能、降低胆固醇、预防各种疾病等;所产乳酸菌素因高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点在食品贮存、发酵、畜牧、化妆品等领域获得越来越广的应用。本研究从传统发酵食品中分离乳酸菌,通过产乳酸菌素验证、体外酸耐受性实验、胆盐耐受性实验、HT-29细胞黏附性实验、产β-葡萄糖苷酶验证等指标筛选出具有益生功能的乳酸菌菌株,对其进行鉴定,并对其益生功能及在食品加工上的应用进行了研究,主要研究结果如下:(1)益生乳酸菌的筛选鉴定通过牛津杯法,从300株分离纯化自发酵食品的乳酸菌中,获得10株可产乳酸菌素的菌株,按抑菌效果大小排列分别为MPE、MP166、MP30、MP85、MP159、MP149、LP4、MPN5、MP170、MPC;耐酸性实验表明,这10株菌均能在pH 3.0条件下存活,且其中MP30、MP85、MP166、MPC、MPN5、MP149、MP170等7株可在此pH条件下生长;胆盐耐受实验表明,LP4、MP30、MP166、MPN5、MP149、MP159、MP170等7株菌株可在胆盐中保持50%以上的存活率;细胞黏附实验表明,菌株MP166对HT-29的黏附性最高,可超过100个细菌/细胞,其次为LP4和MP30,分别为36个细菌/细胞和12个细菌/细胞,其余菌株黏附性则较差,都低于5个细菌/细胞;这10株菌均能产生β-葡萄糖苷酶,其中菌株MP166、LP4和MPC在发酵豆乳中产游离型大豆异黄酮能力较强。综合以上结果,选择MP166为目标菌株进行下一步研究。通过形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析等方法鉴定菌株MP166为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),其16S rRNA基因序列在GenBank中的注册号为KJ610831。(2)MP166菌株益生功能的研究小鼠灌服实验表明,MP166活菌体能使小鼠肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌明显增加,大肠杆菌和肠球菌显著减少(P0.05或P0.01);热灭活菌体也能显著降低大肠杆菌和肠球菌的数量;MP166中剂量组(P0.05)和高剂量组(P0.01)小鼠脾脏指数和胸腺指数都显著提高,且小鼠肠黏膜SIgA含量极显著增加(P0.01);MP166菌体和细胞裂解液在体外对DPPH·自由基和羟自由基都有良好的清除能力;在体内MP166中剂量组和高剂量组可以有效提高小鼠血液中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性并降低丙二醛(MDA)的含量(P0.05或P0.01);且MP166使用安全。以上结果表明,MP166具有良好的益生功能。(3)MP166乳酸菌素的纯化及其理化性质研究通过对MP166产乳酸菌素的培养基及培养条件进行优化发现,其产乳酸菌素的最适培养基为MRS培养基,最佳发酵条件为发酵液初始pH 6.5、1%的接种量、36?C发酵24h。经硫酸铵盐析、凝胶层析、阳离子交换层析、SDS-PAGE、ESI-Q-TOF等方法对产物进行分离纯化和检测,获得的乳酸菌素具有较强的热稳定性,120?C处理20min仍保持活力,并且对强酸强碱(pH 2-10)、紫外线(UV)、表面活性剂(Tween 20、Tween80)和高盐(NaCl)等环境因子也具有较强的承受力;抑菌方式测定表明,其抑菌作用方式为非Lantibiotic型。(4)MP166乳酸菌素在食品贮存中的应用研究将纯化的乳酸菌素应用于食品贮存,发现其在4?C和20?C条件下可将原料乳保质期延长1-3倍,对于消毒乳,其在20?C、4?C下保质期可分别延长5倍和超过10倍;在4?C条件下可将猪肉保质期延长3-4倍;并且能明显抑制单核细胞增生李斯特氏菌在牛乳及猪肉中的繁殖。(5)MP166在发酵豆乳上的应用研究通过单因素实验和响应面优化实验,研究了MP166菌株对发酵豆乳中游离大豆异黄酮含量的影响,获得最佳发酵条件为:发酵温度42.59?C、初始pH7.47、接种量5.01%,在此条件下,发酵豆乳中游离大豆异黄酮的含量可达69.06μg/mL,是未发酵豆乳中游离大豆异黄酮的6.14倍。测定豆乳在发酵期间的酸度曲线、蛋白水解能力、活菌数、脱水收缩性等指标表明,L.plantarum MP166在豆乳中生长良好,发酵结束时活菌数可达到4.5×108 CFU/m L,且豆乳蛋白水解性和持水力都显著增加。


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