小尾寒羊ANKRD2基因的克隆、结构特征与表达分析

【摘要】：锚定重复蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三个保守的成员组成:心肌锚定重复蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌锚定重复蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和锚定重复蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本试验根据实验室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二头肌转录组测序数据,对两个转录本差异表达基因进行筛选,挖掘到差异表达基因ANKRD2为本研究的目的基因。ANKRD2基因特异性表达于骨骼肌,在骨骼肌生长发育过程中起重要作用,参与肌细胞的分化与肌纤维的形成和成熟。目前关于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子结构和组织表达尚未见报道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全长cDNA序列并对其编码的蛋白进行了一系列的生物信息学分析,在mRNA水平和蛋白水平上对小尾寒羊和杜泊羊的组织表达进行了分析。主要研究结果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全长cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全长1179 bp,包含990 bp的开放阅读框、21 bp的5′非编码区(5′UTR)和168 bp的3′非编码区(3′UTR)。其中,开放阅读框编码329个氨基酸的多肽链。我们克隆该基因并将其提交在Genbank上,登陆号是KR090892。在NCBI上下载该基因的预测序列,与我们克隆的序列进行比对,发现相似率约99.40%,CDS区存在2个碱基突变位点。(2)生物信息学分析显示,ANKRD2基因编码的蛋白分子量为36.7 kDa,脂溶指数为87.48(60),蛋白的流动性较大。不稳定指数为49.57(40),蛋白的稳定性一般。疏水性指数为-0.6,说明它为水溶性蛋白,且亲水性较好。等电点为5.72,为偏酸性蛋白,氨基酸组分最多的是谷氨酸。预测蛋白质的二级结构是α螺旋和无规则卷曲。生物信息学软件分析发现其C值、S值和Y值均小于0.5,推断其不含有蛋白信号肽,属于非跨膜蛋白,故不能被分泌到细胞外发挥作用。在氨基酸序列中,发现14个磷酸化位点,12个泛素化位点,10个糖基化位点,4个锚定重复结构域。利用Swiss-model软件预测发现模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)与我们所研究的蛋白拥有最相似的三级结构。(3)将获得的小尾寒羊该基因编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析,发现小尾寒羊ANKRD2氨基酸与所选物种的相似性均在86%以上,说明该蛋白在哺乳动物中高度保守,系统进化树分析发现绵羊的遗传距离与山羊、牛、马相距较近,与人类、猪、鼠、虎鲸的遗传距离相距较远。(4)通过荧光定量PCR和Western-blot技术分析该基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的组织间的表达情况,发现该基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈现出组织表达差异性。研究发现该基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表达,在骨骼肌中的表达量最高,显著高于其他组织(p0.05)。此外,在骨骼肌组织中,杜泊羊ANKRD2蛋白表达量显著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他组织中,蛋白表达量无显著差异。综上所述,本研究从mRNA水平和蛋白水平对小尾寒羊ANKRD2基因展开了较为系统的研究,并且验证了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同组织中的表达情况,为地方品种小尾寒羊经济性状的改良和分子育种提供理论依据。