小尾寒羊三个慢型骨骼肌肌钙蛋白的基因克隆、结构特征及组织表达分析

【摘要】：慢型骨骼肌肌钙蛋白基因主要包括肌钙蛋白C 1基因(Troponin C type 1,TNNC1)、肌钙蛋白I 1基因(Troponin I type 1,TNNI1)和肌钙蛋白T 1基因(Troponin T type 1,TNNT1),它们对骨骼肌的收缩、骨骼肌肌肉纤维特性及多种疾病的发生有密切关系。目前,有关绵羊的TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的全长核酸序列未见报道。本试验采用RT-PCR、RACE、生物信息学分析、荧光定量PCR等技术方法,克隆了小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的全长序列,预测分析了其对应蛋白的序列和特性,构建了其在小尾寒羊和杜泊羊多种组织的表达谱,从分子水平上探索了小尾寒羊三个基因的主要结构和表达特性。主要结果如下:(1)克隆测序得到了小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的cDNA序列,其中TNNI1包含两个5′端有区别的序列,并分别命名为TNNI1a和TNNI1b。得到的TNNC1、TNNI1a和TNNT1基因的全长cDNA序列及TNNI1b基因的部分cDNA序列已提交至GenBank,并分别获得登录号为KR153938、KT218688、KT218689及KT218690。相应的编码氨基酸长度分别为161、187、194和263个氨基酸。(2)cTnC蛋白为偏酸性蛋白,且结构比较稳定,亲水性比较好,流动性比较大;ssTnI蛋白两种亚型均为偏碱性蛋白,且结构相对不稳定,亲水性比较好;ssTnT蛋白为偏酸性蛋白,流动性一般,结构不是很稳定,但亲水性比较好,流动性比较大。cTnC、ssTnI和ssTnT蛋白均没有跨膜结构域,含有多个磷酸化位点,无任何N-糖基化位点,预测为非分泌性蛋白质。二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。(3)多物种氨基酸序列比对结果显示:cTnC蛋白的氨基酸序列在本试验分析的物种中高度保守。ssTnI两亚型蛋白和ssTnT蛋白的氨基酸序列均与试验中其它哺乳动物的保守性比较高,而与试验中其它的非哺乳动物的保守性相对较差。系统进化树结果显示:绵羊的cTnC蛋白最先与野猪、家牛和山羊聚到一类;绵羊的ssTnI蛋白最先与山羊和家牛聚到一类;绵羊的ssTnT蛋白最先与野猪和家牛聚到一类。上述结果表明小尾寒羊中的cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白均与试验中的其它哺乳动物的关系比较近。(4)TNNC1、TNNI1和TNNT1基因在小尾寒羊和杜泊羊的多种组织中的表达情况不同,然而,这几个基因的表达模式却存在一定的共性。TNNC1、TNNI1和TNNT1基因均在肋间肌、股二头肌和背最长肌中高表达,且其表达量均为肋间肌股二头肌背最长肌。小尾寒羊和杜泊羊中TNNI1a基因在每个组织中的表达量都高于TNNI1b基因在各组织中的表达量。此外,TNNC1、TNNI1和TNNT1基因在小尾寒羊和杜泊羊两品种羊中的表达量也存在明显的区别。特别的,TNNI1a在小尾寒羊肋间肌中的表达量显著高于其在杜泊羊中的表达量(p0.05)。三个基因对应的蛋白均在背最长肌、肋间肌、股二头肌中存在表达,此外,在两品种羊的心肌中,cTnC蛋白也存在表达,而ssTn I和ssTnT蛋白则不存在表达。综上所述,本试验成功克隆了小尾寒羊的TNNC1、TNNI1和TNNT1基因,并对其展开了较为系统的研究。从分子水平探索上述基因的特性及功能,为后续基因功能的研究和分子育种提供基本的理论依据。